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最初研究发现抵抗素是一种胰岛素抵抗的信号分子,但目前更被认为是一种促炎因子或炎症因子的效应分子,参与炎症的发生发展过程。抵抗素具有活化猪肺泡巨噬细胞(PAMs)并促进IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性细胞因子表达释放的作用,TLR4是其参与炎症与免疫的重要信号通路。为进一步明确重组抵抗素的生物活性,及其与牛肺泡巨噬细胞(BAMs)的作用机制,试验通过原核表达重组牛抵抗素,探讨了其对小鼠血常规指标及BAMs炎性细胞因子表达调控的影响。试验一重组牛抵抗素基因克隆及高效可溶性表达以健康犊牛大网膜脂肪组织为原料提取总RNA,根据Genbank中牛抵抗素基因序列(NM-183362.1)设计扩增引物,通过RT-PCR扩增获得目的基因,连接PMD19-T载体,然后克隆至原核表达载体PET-21a,构建重组表达质粒PET-Resistin。对宿主菌(E.coli BL21和E.coli Rosetta)、IPTG浓度(0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L)、诱导温度(20℃、25℃、30℃、35℃)及时间(10 h、12 h、14 h、16 h)等重组牛抵抗素的表达条件进行了优化,用抗His标签抗体鉴定表达融合蛋白为重组抵抗素,镍柱纯化获得了高纯度的重组抵抗素。结果:在宿主菌Rosetta,IPTG终浓度1.0 mmol/L,诱导温度20℃,诱导14 h时情况下,表达牛抵抗素的量最高;重组牛抵抗素存在于上清液中,通过镍柱过滤法可将其提纯。试验二重组牛抵抗素对小鼠血常规指标的影响将120只30日龄的昆明小鼠随机分为4组,30只/组,其中I、II、III、IV组分别按0 mg/只、0.25 mg/只、0.5 mg/只、1.0 mg/只剂量腹腔注射重组抵抗素。分别采集0 h(注射前)及注射后6 h、24 h的全血,肝素抗凝,用于检测血常规指标。结果:(1)白细胞(WBC),在6 h,II、III、IV组显著高于I组(P<0.01),III组显著高于II、IV组(P<0.01);在24 h,II、III组显著高于I、IV组(P<0.01),II显著高于III组(P<0.01)。(2)嗜中性粒细胞(Neu),在6 h,II、III、IV组极显著高于I组,III、IV显著高于II组(P<0.01);在24 h,II组极显著高于I、IV组(P<0.01)。(3)淋巴细胞(Lym),在6 h,III、IV组极显著低于I、II组(P<0.01);在24 h,II、III组极显著高于I、IV组,II显著极显著高于III组(P<0.01)。(4)单核细胞(Mon)、嗜酸性粒细胞(EOS),在24 h,II组极显著极显著高于I、III、IV组(P<0.01)。(5)嗜碱性粒细胞(Bas),在24 h,II组极显著高于I、III、IV组,III、IV组极显著高于I组(P<0.01)。(6)红细胞(RBC)、红细胞压积(HCT)、血红蛋白浓度(HGB),6 h及24 h,II、III、IV组均极显著低于I组。(7)血小板数目(PLT),在6 h,IV组显著低于I、II、III组(P<0.01);在24 h,II、III、IV组显著低于I组(P<0.01或P<0.05),II组显著低于III组(P<0.01)。(8)血小板压积(PCT),在6 h,III、IV组显著低于I、II组(P<0.01或P<0.05),III组显著高于IV组(P<0.01);在24 h,II、III、IV组均极显著低于I组。上述结果表明,重组抵抗素具有促进小鼠血液中白细胞(主要包括Neu和Lym)增加;降低RBC、HGB及PLT的生物活性。试验三重组牛抵抗素对牛肺泡巨噬细胞炎性细胞因子释放及相关基因表达的影响试验分为I、II、III、IV组,分别用终浓度为0 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL和500 ng/mL的重组牛抵抗素孵育BAMs,收集培养0 h、1.5 h、3 h、6 h、12 h和24 h的细胞上清和下层细胞。检测上清中IL-1β、IL-6和TNF-α的浓度;下层细胞PPARγ、TLR4、MyD88、IRAK4、TRAM和NF-κB的基因和蛋白表达变化。结果:(1)上清液中炎性细胞因子变化:(1)IL-1β,在1.5 h、3 h、6 h、12 h、24 h,III、IV组显著高于I、II组,其中在3 h、6 h、12 h、24 h,II组显著高于I组(P<0.05);IV组在1.5 h、3 h、6 h显著高于III组,在24 h显著低于III组(P<0.05)。(2)IL-6,在1.5 h、3 h、6 h、12 h、24 h,II、III、IV组显著高于I组,其间III、IV组又显著高于II组(P<0.05);IV组在1.5 h、3 h、6 h、12 h显著高于III组,在24 h显著低于III组(P<0.05)。(3)TNF-α,在1.5 h、3 h、6 h、12 h,III、IV组显著高于I、II组,其中IV组在1.5 h、3 h、6 h显著高于III组,在12 h、24 h显著低于III组(P<0.05);II组在3 h、6 h、12 h、24 h均显著高于I组,III、IV组在24 h显著高于I组,III组在24 h显著高于II组(P<0.05)。表明重组抵抗素具有促进IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎细胞因子释放的作用,其作用效果与重组抵抗素的作用浓度和时间有关。(2)BAMs的mRNA变化:PPARγ,III、IV组在1.5 h、3 h、6 h、12 h、24 h及II在6 h、12 h、24 h均显著低于I组(P<0.05);II组在1.5 h、3 h显著高于III、IV组,在12 h、24 h显著低于IV组(P<0.05);IV组在12 h、24 h显著高于III组(P<0.05)。TLR4、MyD88、IRAK4、TRAM、NF-κB,在6 h、12 h、24 h,II、III、IV组显著高于I组,此外,IV组的TRAM在3 h也显著高于I组(P<0.05);其中,TLR4在6h、12 h、24 h,III、IV显著高于II组,IV组在12 h显著高于III组(P<0.05);MyD88在6 h、12 h,III、IV组显著高于II组(P<0.05);IRAK4在6 h、12 h、24h,III、IV显著高于II组,III组在12 h和24 h显著高于IV组(P<0.05);TRAM在6 h、12 h,III、IV组显著高于II组,III、IV组在24 h显著低于II组,IV组在12h显著低于III组,III组在24 h显著低于IV组(P<0.05);NF-κB在6 h、12 h,III、IV组显著高于II组,IV组在24 h显著高于II、III组(P<0.05)。表明重组抵抗素具有上调BAMs中TLR4、MyD88、IRAK4、TRAM、NF-κB等基因表达,抑制PPARγ基因表达的作用,但PPARγ的基因表达抑制先于其他基因表达上调。(3)BAMs的蛋白变化:III组12 h的PPARγ蛋白表达显著低于I组(P<0.05),TLR4、MyD88、IRAK4、TRAM和NF-κB等蛋白表达显著高于I组(P<0.05),其结果与mRNA表达变化一致。结果表明,重组抵抗素具有抑制BAMs中PPARγ蛋白表达,进而上调TLR4、MyD88、IRAK4、TRAM、NF-κB等蛋白表达的作用。结论:1.成功构建了重组牛抵抗素的高效可溶性表达体系:宿主菌Rosetta,IPTG终浓度1.0 mmol/L,诱导温度20℃,诱导时间14 h,并通过镍柱过滤将其纯化。2.重组牛抵抗素具有促进小鼠血液中WBC(主要包括Neu和Lym)增加,RBC、HGB及PLT降低的作用。3.重组牛抵抗素具有激活TLR4/NF-κB信号通路,促进BAMs中IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎细胞因子释放的作用。其机制与重组抵抗素抑制PPARγ,上调TLR4、MyD88、IRAK4、TRAM、NF-κB等基因和蛋白的表达有关。