可降解杀菌剂百菌清与多菌灵融合菌的构建及其降解特性的初步研究

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随着杀菌剂百菌清和多菌灵等化学农药在中国使用量的增大,其残留问题也越来越引起人们的重视。百菌清是一种广谱、保护性杀菌剂,在农业生产中使用广泛,土壤、水体、温室与农产品中检测到百菌清已有许多报道。多菌灵是一种广谱、内吸性杀菌剂,在工农业生产中广泛应用,是杀菌剂类产量和用量最大的品种之一。它在自然界中的半衰期很长,即使在低剂量时就能够对哺乳动物等产生严重的“三致”影响。目前,减轻杀菌剂百菌清和多菌灵在土壤中污染的主要途径包括光解和微生物降解。与光解相比,微生物降解具有处理效率高、使用成本低、无二次污染等优势。因此筛选出高效降解两种杀菌剂的菌株对于杀菌剂复合污染土壤的生物修复具有重要的意义。微生物育种手段之一的原生质体融合技术具备遗传物质传递完整且定向性好,高育种效率等优点,更可以克服单一杀菌剂微生物降解谱窄的局限性。该技术已经被广泛用于污染物处理工程菌的研究,研究效果显著。目前,将原生质体融合技术运用于杀菌剂百菌清和多菌灵降解菌的遗传育种方面的研究尚未见报道。本课题的研究意义在于通过构建可同时降解杀菌剂百菌清和多菌灵的多功能遗传工程菌,用于混剂污染土壤的生物修复,可以为百菌清和多菌灵复合污染土壤的生物修复提供新的途径,更好地解决百菌清和多菌灵对环境的污染问题。本文主要以杀菌剂百菌清和多菌灵为研究对象,分离鉴定其高效降解菌株,并对该菌株的生长、降解特性进行研究。试图以筛选到的功能菌株为亲本,通过原生质体融合技术构建可同时降解杀菌剂百菌清和多菌灵的融合菌株,并对该融合菌的生长条件及降解情况进行探索。主要研究结果如下:1.本文通过富集培养的方法,分别从百菌清和多菌灵污染的样品中分离到1株百菌清降解菌株,命名为CTN-5,和使用本实验室已经分离出来的一株百菌清降解菌CTN-16;1株多菌灵降解菌株,命名为MBC-3。对上述降解菌株进行生理生化鉴定和系统发育分析,分别被鉴定为Bordetella sp.CTN-16、Brucella sp.CTN-5和Microbacterium sp.MBC-3。2.对CTN-16和MBC-3与CTN-5和MBC-3基于原生质体融合技术分别构建融合菌。其中抗生素筛选实验表明,第一组中CTN-16对卡那霉素敏感,MBC-3对氨苄青霉素具有抗性,第二组中CTN-5对遗传霉素敏感,MBC-3对氨苄青霉素具有抗性。因此第一组以卡那霉素与氨苄青霉素作为遗传标记筛选融合菌,另一组以遗传霉素与氨苄青霉素作为遗传标记筛选融合菌。获得可在含有双抗生素培养基中稳定继代8代以上的融合菌2株,分别命名为BD2与BD3。3.BD2被鉴定为Enterobacter sp.BD2,为革兰氏阴性细菌,呈短杆状。该菌种不同于其亲本的菌属划分,这可能是由于在融合过程中16S r RNA的基因序列发生重组或基因组发生重组所致,具体机制需进一步通过基因组测序等方式探索。其生理生化性状较偏向于菌株CTN-16,但与菌株MBC-3相同的生理生化性状也有相似之处,初步说明了融合菌BD2可能遗传了2亲本的一些遗传特性。BD3被鉴定为Brucella sp.BD3,其生理生化性状较偏向于菌株CTN-5,但与菌株MBC-3相同的生理生化性状也有相似之处,初步说明了融合菌BD3可能遗传了2亲本的一些遗传特性。4.根据随机扩增DNA多态性分析结果显示:BD2中既有与CTN-16与MBC-3菌株相同的条带,又有区别于亲本的特异性条带,BD3中也同样有上述情况。证明两亲本菌株在原生质体的融合过程中其遗传物质确实发生了交流。BD2与2亲本的遗传相似性指数分别为0.571和0.428,BD3分别为0.778和0.444。5.融合菌BD2在无机盐培养液中的最佳生长条件为:接种量5%、培养温度30℃、培养基p H 7.5;融合菌BD3在无机盐培养液中的最佳生长条件为:接种量5%、培养温度32℃、培养基p H 7.5。此条件下,BD2在含50 mg·L-1农药的无机盐培养基中培养5天后,其对百菌清和多菌灵的降解率分别为79.8%和65.2%;BD3在同样培养条件下降解率分别为80.2%和60.3%。
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