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微囊藻毒素(Microcystins,MCs)是淡水蓝藻产生的一类由七个氨基酸组成的天然毒素,具有强烈的肝毒性、神经毒性、肾毒性和胃肠道毒性[1-3]。本课题组率先发现MCs具有雄性生殖毒性。我们在前期研究中,分别通过急性和慢性实验证明了MC-LR(水体中分布最广、毒性最强的一种MCs异构体)染毒雄性大鼠后,引起机体睾酮水平明显下降,其下降幅度为60%～80%[4]。在雄性动物体内,睾丸间质细胞是合成睾酮的重要场所。而体内体外实验均表明,MC-LR不能进入间质细胞,对间质细胞没有明显的损伤作用[5]。间质细胞合成睾酮受下丘脑-腺垂体-睾丸轴的调控。下丘脑GnRH神经元分泌的GnRH间接调控间质细胞合成睾酮。前期结果表明,MC-LR能够有效进入下丘脑组织,下调GnRH的量[6]。已知,GnRH由下丘脑中GnRH神经元分泌。由于GnRH神经元数量少,在下丘脑分布零散,我们使用GT1-7细胞进行后续的机制研究。GT1-7细胞能稳定的分泌GnRH,是研究GnRH神经元的理想细胞株[7-8]。本研究探讨MC-LR进入GT1-7细胞后,抑制GnRH合成的分子机制。全文分为三部分:第一部分MC-LR对GT1-7细胞miRNA表达谱的影响一、目的探究MC-LR对GT1-7细胞miRNA表达谱的影响,筛选与GnRH合成相关的miRNA。二、方法1.GT1-7细胞均分10组进行各项指标的检测,即Control、1nM、10nM、100nM、500nM、1μM、5μM、10μM、50μM、1000μM MC-LR组。2.光镜下观察细胞形态,采用CCK-8法,检测MC-LR对GC-1细胞形态,活力和存活率的影响,确认GT1-7细胞最佳的染毒浓度和时间,为进行miRNA芯片筛选选择最佳染毒条件。3.采用miRNA杂交芯片法,筛选出MC-LR染毒GT1-7细胞后,细胞中表达变化的miRNA。采用qPCR实验技术验证芯片的可靠性。4.miR-329-3p靶基因的预测和验证:采用miRanda、Targetscan及microRNA.org等生物信息学软件预测差异变化miRNA的靶基因,借此筛选出与GnRH合成相关的miRNA。分别构建含Prkarla、Prkacb与miR-329-3p互补配对碱基序列的荧光素酶报告基因重组质粒,采用脂质体转染外源性miR-329-3p或negative control和重组质粒或空载质粒进入293T细胞,验证miR-329-3p与Prkarla、Prkacb之间的作用关系。5.使用Promega试剂盒检测MC-LR染毒后GT1-7细胞中PKA的酶活性是否改变。三、结果1.采用CCK-8法检测细胞活力发现:随着MC-LR染毒浓度和染毒时间的增加,细胞活性呈现下降趋势。100nM-100μM组染毒48h,GT1-7细胞活力显著降低。光镜下观察细胞的形态发现:0-1000 nM组细胞形态未明显改变,10 μM和100 μM组细胞呈圆形并悬浮于培养基中。2.MC-LR对GT1-7细胞miRNA表达谱的影响:500 nM MC-LR染毒GT1-7细胞48 h,通过对比GT1-7细胞染毒前后miRNA的变化,发现101种miRNA发生明显改变,其中42种显著上调,59种显著下调。其中,上调最明显的是miR-544-3p,上调了 10.67倍。下调最明显的是miR-329-3p,下调了 9.5倍。qPCR证实表达差异的miRNAs结果与芯片一致。3.通过综合比对不同数据库发现下调最显著的miR-329-3p与PKA激酶的调节亚基prkarla,prkacb和催化亚基存在结合位点。与转染阴性对照组质粒相比,转染了miR-329-3p质粒后能显著降低装载野生型Prkarla、Prkacb序列的荧光素酶活性,而对阴性对照荧光素酶质粒和装载突变型Prkarla、Prkacb序列的荧光素酶活性没有影响。4.使用Promega试剂盒检测MC-LR染毒后GT1-7细胞中PKA的酶活改变,MC-LR染毒GT1-7细胞后激活PKA酶。四、结论1.MC-LR染毒GT1-7细胞后,使其miRNA表达谱发生改变,42种miRNA显著上调,59种miRNA显著下调。其中,上调最明显的是miR-544-3p,上调了 10.67倍。下调最明显的是miR-329-3p,下调了 9.5倍。2.通过荧光素酶报告基因实验证实PKA酶的调节亚基Prkarla和催化亚基Prkacb是miR-329-3p的靶基因。3.MC-LR染毒GT1-7细胞激活PKA酶。第二部分探究MC-LR激活PKA通路对GT1-7细胞合成GnRH的影响及分子机制一、目的探究MC-LR染毒GT1-7细胞激活PKA酶后,对GT1-7细胞合成GnRH的影响及其分子机制。二、方法1.不同浓度MC-LR不同时间点染毒GT1-7细胞,qPCR和Elisa分别检测GnRH在转录水平和释放水平的表达量变化。2.500nMMC-LR染毒GT1-7细胞0、0.25、0.5、1、3、6h,和0、10nM、100nM、500 nM MC-LR染毒GT1-7细胞48 h后,qPCR检测Prkarla、Prkacb、c-Jun、c-Fos基因表达变化;Elisa检测cAMP含量变化;Western Blot检测PRKAR1A、PRKACB、c-Jun、c-Fos、CREB、p-CREB蛋白的表达量变化。3.PKA抑制剂H-89 2HCl(10μM)处理GT1-7细胞1h,500nMMC-LR染毒24h后,qPCR和Elisa分别检测GnRH表达量变化,Westernblot检测CREB、p-CREB蛋白的表达量变化。4.500nMMC-LR染毒GT1-7细胞6 h,染色质免疫沉淀技术(CHIP)检测p-CREB与c-Fos、c-Jun启动子的结合含量变化,c-Fos、c-Jun与GnRH启动子和增强子的结合含量变化。三、结果1.qPCR检测MC-LR染毒GT1-7细胞后GnRH在转录水平的表达量,结果表明:随着MC-LR染毒浓度和染毒时间的增加,GnRH的合成受到抑制。Elisa检测GnRH在释放水平表达量发现:低浓度(5 nM)MC-LR刺激GT1-7细胞释放GnRH,高浓度(500 nM)抑制GnRH的释放。2.qPCR 检测发现:MC-LR 染毒 GT1-7 细胞后,Prkarla、Prkacb、c-Jun、c-Fos 基因表达上调,提示PKA通路激活。Westernblot检测发现:MC-LR染毒GT1-7细胞后,PRKAR1A、PRKACB、c-Jun、c-Fos、p-CREB 蛋白表达量上调,进一步验证PKA通路激活。3.PKA抑制剂处理GT1-7细胞1 h后,500 nM MC-LR染毒24 h发现:加入抑制剂后,MC-LR对GnRH的抑制作用消除。4.CHIP实验发现:MC-LR染毒GT1-7细胞后,p-CREB与c-Fos、c-Jun启动子的结合量增多,c-Fos、c-Jun与GnRH启动子和增强子的结合量增多。四、结论1.MC-LR染毒GT1-7细胞,导致细胞活性下降,抑制GnRH的合成,低浓度(5nM)MC-LR促进GnRH的释放,高浓度(500 nM)抑制GnRH的释放。2.MC-LR通过激活PKA-p-CREB-c-Fos/c-Jun这条通路抑制GnRH的合成。第三部分调控miR-329-3p对MC-LR影响GnRH合成的干预作用一、目的调控miR-329-3p的表达,探讨miR-329-3p对MC-LR影响GnRH合成的干预作用。二、方法1.采用脂质体转染外源性 miR-329-3p mimics、inhibitors 或 miRNA negative control进入GT1-7细胞,qPCR检测miR-329-3p和GnRH mRNA表达水,采用Western检测 PRKACA、PRKACB、p-CREB、CREB、c-Fos、c-Jun 的含量变化。2.GT1-7 细胞转染 miR-329-3p mimic,同时染毒 500 nM MC-LR,采用 qPCR 法检测GnRH mRNA表达水平;采用Western blot实验技术检测PRKACA、PRKACB、p-CREB、CREB、c-Fos、c-Jun 蛋白表达水平。三、结果1.与对照组相比,miR-329-3p mimics后能显著升高miR-329-3p的表达量,PRKACA、PRKACB表达量随之下降,促进GnRH的转录;而miR-329-3p inhibitor组miR-329-3p表达量显著下调,PRKACA、PRKACB表达量显著上调,抑制GnRH的转录。2.与对照组相比,同时转染miR-329-3pmimics和MC-LR组可以消除MC-LR引起的 PRKACA、PRKACB、c-Jun、c-Fos、p-CREB 的上调,有效逆转 MC-LR 对GnRH合成的抑制作用。四、结论1.miR-329-3p可以调控PKA酶的调节亚基Prkarla和催化亚基Prkacb的表达。2.调控miR-329-3p的表达可以影响GnRH合成,上调miR-329-3p的表达可以促进GnRH的合成,下调miR-329-3p的表达抑制GnRH的合成。3.过表达miR-329-3p抑制了 PKA通路的激活,有效逆转了因MC-LR激活PKA通路引起的对GnRH合成的抑制作用。