细胞因子长效缓释静电纺丝纤维的制备及其用于组织修复的可行性研究

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聚合物静电纺丝纤维膜具有类似细胞外基质(ECM)的三维网状结构,从而提供细胞生长所需的结构环境,作为组织修复支架展现出了一定的优势。如果组织工程纤维能在修复部位维持诱导干细胞定向分化的细胞因子蛋白的有效浓度,将为组织再生治疗提供更为理想的仿生环境。然而,实现上述目标面临着一系列棘手而必须一并克服的技术挑战,如细胞因子蛋白在包封于组织工程纤维并实现相对恒定而长时间的缓释的同时需保持其自然构象,不发生变性,不产生有害抗体。实现长效缓释的组织工程纤维同时还须在支架部位维持既定的形状、足够的机械强度、以及与周围组织兼容的表面。针对上述挑战,本课题运用所在实验室在材料学(串珠纤维对蛋白的包封、聚乙烯醇电纺纤维的微晶交联)和生物大分子药剂学(基于水相-水相乳化的蛋白预制剂)上的一系列发明,选择神经生长因子(NGF)和血管内皮生长因子(VEGF165)为模型蛋白,设计并制备出能够稳定生物活性并长效缓释细胞因子蛋白的静电纺丝纤维,并通过组织的修复实验进行了验证。首先,我们通过条件优化,制备出粒径足够小且分布更均一的NGF-葡聚糖纳米颗粒和VEGF165-葡聚糖纳米颗粒;进而结合电纺纤维的结构特征以及颗粒粒径和理化性质,继续尝试摸索不同参数分别制备出具有串珠结构、表面涂层的担载上述颗粒的电纺纤维,考察其缓释细胞因子的动力学特征和蛋白构象稳定性,及其用于外周神经缺损模型的修复效果。我们确定了摸索并确立了PLLA串珠纤维的最佳电纺条件为浓度55mg/ml、电压10kv,距离15cm,流速1ml/h;PVA纤维膜在润湿48h后进行冷冻-解冻4次时的微晶交联效果最好。在此基础上,我们将PVA纤维作为外表面涂层修饰载有NGF的PLLA串珠纤维,在与不同方法制备的组织工程纤维的对比测试中发现上述复合纤维同时具有理想的表面性质和力学强度。我们将上述方法用于载有VEGF165的PLGA纤维膜的制备,用ELISA试剂盒对三种不同的纤维膜的体外释放进行检测,结果表明葡聚糖能够很好的保护蛋白活性,并达到缓释效果,且葡聚糖颗粒复合涂层PLGA纤维的缓释效果明显优于葡聚糖颗粒复合PLGA纤维和W/O型乳液法PLGA纤维膜。三种纤维(颗粒复合纤维、颗粒复合涂层纤维和W/O型乳液法纤维)30天后的释放百分比分别为96.17%、92.44%和84.52%(n=3),颗粒法两种纤维膜仍在持续的释放之中,释放总量均达到了50000pg(n=3)。同时制备了担载有FITC-BSA葡聚糖纳米颗粒的PLGA串珠纤维膜,激光共聚焦显微镜观察结果表明大部分蛋白颗粒都地均匀分布在串珠中,从物理结构上验证了通过串珠结构控制突释、提高包封率、保持蛋白活性的设想。此外,本课题利用细胞增殖实验考察NGF的稳定性以及在颗粒和纤维制备过程中的活性变化,结果显示NGF蛋白在先后担载入葡聚糖纳米颗粒和电纺纤维的过程中几乎没有活性丢失,该方法可以很好的保护蛋白活性。最后,建立大鼠坐骨神经缺损模型,将实验室前期所做的NGF-葡聚糖纳米颗粒涂层纤维卷成导管手术缝合,观察8周后神经再生能力。切片的HE染色和甲苯胺蓝染色结果表明:颗粒串珠纤维组和颗粒涂层串珠纤维组修复神经的效果很好,如同自体神经移植组,预示着在外周神经再生方面有一定的应用前景。
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