论文部分内容阅读
研究背景动脉粥样硬化是一种古老的疾病,也是诱发很多类似冠心病等心血管疾病的首要病因。目前,心血管疾病在世界范围内己经成为死亡的首要病因。他汀类药物是冠心病、高血压以及脑血管病的预防药物。其中的阿托伐他汀进入体内不需代谢即可有生物活性,具有见效快、降脂作用强以及持续时间长等优点,可有效降低心血管疾病的发生率和死亡率。因此,我们根据阿托伐他汀治疗前后M2标志物在人类循环单核细胞中的变化,判断该药物是否具有激活PPARγ从而促使单核细胞向M2巨噬细胞分化的能力,并对其机制进行深入探索,为进一步了解阿托伐他汀治病机制奠定基础。动脉血管内皮细胞的损伤、脂质的浸润等病理反应都能影响动脉粥样硬化斑块的发生和发展。因此,从动脉粥样硬化斑块的形成发展机制方面,如氧化应激、炎症、凝血及免疫水平的变化,选取能反映这些改变的血浆胱抑素C（Cys C）、同型半胱氨酸（Hcy）、D-二聚体（D-D）、超敏C反应蛋白（hs-CRP）、尿酸（UA）、丙二醛（MDA）、白介素-6（IL-6）、纤维蛋白原（FIB）、可溶性CD40配体（s CD40L）、脂蛋白（a）[LP（a）]、血清淀粉样蛋白A（SAA）这11种炎症因子,为临床早期发现动脉粥样硬化及动脉粥样硬化斑块的发展情况奠定理论依据。近年来,数据挖掘方面的生物信息学越来越热门,其中主要的就是数据挖掘,包括数据库、统计学、机器学习和人工智能等许多领域。因此,在对动脉粥样硬化相关炎症因子进行测定后,我们可以基于逐步Logistic回归分析对其进一步筛选,评价其在动脉粥样硬化诊断中的应用价值,并基于支持向量机、BP神经网络、Logistic回归分析及受试者工作曲线（ROC）方法,建立动脉粥样硬化早期诊断的炎症因子诊断模型,以辅助医生进行诊断,提高确诊率。研究目的本研究旨在评价阿托伐他汀治疗前后M2标志物在人类循环单核细胞中的变化,判断该药物是否具有激活PPARγ从而促使单核细胞向M2巨噬细胞分化的能力,并对其机制进行深入探索,为进一步了解阿托伐他汀治病机制。检测炎症因子,旨在为临床早期发现动脉粥样硬化及动脉粥样硬化斑块的发展情况奠定理论依据,建立动脉粥样硬化早期诊断的炎症因子诊断模型,以辅助医生进行诊断,提高确诊率。材料与方法1.将纳入20位郑州大学第一附属医院收治的没有糖尿病的且刚刚被确诊为冠状动脉疾病的患者,对他们实施阿托伐他汀治疗。在治疗的前一天以及治疗后的两个月分别采集患者的外周静脉血10ml供于研究。用聚蔗糖-泛影葡胺（Ficoll-Hypaque）密度梯度离心法采取人类外周血单个核细胞,用实时荧光定量PCR检测PPARγ、CD206和CD163 m RNA水平。用ELISA法检测TNF-α、MCP-1、PPARγ、ERK和p38 MAPK的总含量、磷酸化ERK和p38 MAPK含量。最后,用Graph Pad Prism 5.0软件对数据进行分析。2.选择动脉粥样硬化患者200例,健康人100例。详细收集记录每一研究对象的临床资料。采集血清,Cys C、Hcy、hs-CRP、UA、TG、TCLDLC、HDL-C,用全自动生化分析仪测定;D-D、LP（a）的检测采用免疫比浊法;IL-6、SAA、s CD40L采用ELISA检测;MDA用比色法。制作炎症因子单独ROC曲线,评价其对动脉粥样硬化的诊断价值。3.基于Logistic回归分析筛选出用于建模的炎症因子;然后分别用ROC曲线、支持向量机、BP神经网络进行动脉粥样硬化早期诊断模型的建立。研究结果1阿托伐他汀对动脉粥样硬化患者外周血中PPARγ的作用研究阿托伐他汀可显著提高CD206、IL-10以及CCL18这些M2标记物的表达水平,但另一种标记物CD163的表达量则仅仅是微微上调,并无显著性差异。PPARγ在循环单核细胞中的表达水平在经阿托伐他汀治疗后也显著上调。在经10μM阿托伐他汀治疗后,随着时间的推移,PPARγm RNA表达不断增多,在12 h和24 h时基本达到稳定。阿托伐他汀的剂量越大,PPARγm RNA表达量越多,且各个剂量之间差异显著。a P2 m RNA水平同PPARγm RNA趋势相同。在经10μM阿托伐他汀治疗24 h后,PPARγm RNA表达水平、活性PPARγ水平以及a P2 m RNA表达水平均可受到PPARγ激动剂和拮抗剂的影响。体外试验表明,在M2巨噬细胞中,阿托伐他汀可增强由IL-4所引发的CD163表达水平下降的效果。用培养M2巨噬细胞的上清液培养M1巨噬细胞可显著抑制TNF-α和MCP-1的表达。阿托伐他汀可显著诱导p38 MAPK的磷酸化,但对ERK1/2的作用不明显。阿托伐他汀所诱导的PPARγ的表达和激活均可被p38 MAPK特异性的抑制剂SB203580显著抑制,且这种抑制作用呈剂量依赖性,而加入MAPK/ERK的特异性抑制剂PD98059时,抑制作用并不明显。2动脉粥样硬化的相关炎症因子的检测两组研究对象的一般资料均无显著性差异;11种炎症因子在动脉粥样硬化组中水平均显著高于健康对照组;ROC曲线可知,每个炎症因子对动脉粥样硬化均有一定的诊断价值,其中敏感性UA最高98,FIB最低55.5;特异性UA最高99,FIB最低78;曲线下面积UA与SAA最高都是0.995,FIB最低0.721。3相关炎症因子对动脉粥样硬化的诊断模型建立被选入Logistic回归方程的自变量有6个,即Hcy、Hs-CRP、IL-6、D-D、Cys C和MDA。分类表明,最后的第六步预测准确率为99%。将纳入logistic回归方程的6个炎症因子进行联合检测,敏感性为57%,特异性97%,曲线下面积0.821;剔除D-D的模型的敏感性为64%,特异性90%,曲线下面积0.828,整体优于全部联合检测。又分别联合Hcy、HsCRP、MDA和IL6、DD、Cys C做ROC曲线分析,结果Hcy、HsCRP、MDA联合的敏感性67%,特异性94%,曲线下面积0.869,差于IL6、DD、Cys C联合的敏感性87%,特异性92%,曲线下面积0.936。建立SVM动脉粥样硬化诊断模型的准确率为82.5%。建立BP神经网络动脉粥样硬化诊断模型的准确率为77.5%。结论1.首次发现,在经阿托伐他汀治疗后人类循环外周血单核细胞中M2标记物大量表达。体内和体外试验都证实阿托伐他汀还可诱导PPARγ在人类单核细胞的表达和激活,由此引起单核细胞向着M2巨噬细胞分化。阿托伐他汀介导的PPARγ的激活和单核细胞趋向于向着M2巨噬细胞分化是通过p38 MAPK而不是ERK1/2实现的。本研究为深入探索阿托伐他汀作用机制奠定了扎实的生物学基础。2.所选的各个炎症因子用ROC曲线来评估对动脉粥样硬化均具有一定的诊断价值。3.Logistic回归分析、ROC联合检测、支持向量机、BP神经网络建立的动脉粥样硬化早期诊断模型均具有一定的诊断价值,可以为医师临床诊断提供一定的参考。