目的近年来肾素血管紧张素系统（RAS）与2型糖尿病的关系日益得到关注，RAS在胰岛β细胞功能障碍发生中的作用及其干预价值成为2型糖尿病防治研究的热点之一。本课题通过长期高脂高热量饮食构建胰岛素抵抗大鼠模型，以高脂饮食加小剂量链尿佐菌素（STZ）腹腔注射构建糖尿病大鼠模型，观察在糖尿病发病的不同阶段阻断RAS对胰岛β细胞功能的保护效应及机制，及其对STZ致糖尿病发生率的影响，并通过体外对β细胞系INS-1细胞的培养及处理，探讨RAS活化参与β细胞功能损害的分子机制。方法（1）阻断RAS对胰岛素抵抗大鼠胰岛β细胞功能的效应及机制，及其对STZ致糖尿病发生率的影响：90只8周龄雄性Wistar大鼠，随机分为正常对照组（n=15）和胰岛素抵抗造模组（n=75）。胰岛素抵抗造模组给予高脂高热量饮食喂养16周，随机分为高脂对照组（n=30），培哚普利干预组（n=15），替米沙坦干预组（n=30），共干预8周。为了观察在胰岛素抵抗阶段阻断RAS对STZ致糖尿病发生率的影响，分别从高脂对照组及替米沙坦干预组中随机选择15只大鼠作为高脂+小剂量STZ腹腔注射组（n=15）及替米沙坦干预+小剂量STZ腹腔注射组（n=15），禁食10-12h，以20mg／kg的剂量腹腔注射STZ，1周后以非同日2次随机血糖≥16.7mmol／1者为糖尿病大鼠，继续喂养1周。（2）阻断RAS对糖尿病大鼠胰岛β细胞功能的效应及机制研究：50只8周龄雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组（n=10）和糖尿病造模组（n=40）。糖尿病组以高脂高热量饮食喂养8周后予小剂量STZ（30mg／kg）腹腔注射诱导糖尿病，纳入标准同上，随机分为糖尿病组（n=8）、ACEI干预组（n=10）、ARB干预组（n=10），共干预8周。（3） RAS参与β细胞功能损害的相关分子机制研究：体外培养β细胞系INS-1细胞，分别用不同浓度葡萄糖处理不同时间，观察其对INS-1细胞血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）受体1（AT1R）表达的影响；用不同浓度的AngⅡ处理24h，观察其对INS-1细胞凋亡、功能以及胰岛素信号分子的影响。动物研究中胰岛结构、β细胞内胰岛素含量、胰岛细胞凋亡、炎症、氧化应激、胰岛微血管密度及RAS表达采用免疫组化或反转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测，胰岛功能采用静脉葡萄糖耐量试验（IVGTT）与静脉胰岛素释放试验（IVIRT）检测，胰岛素敏感性采用高胰岛素正葡萄糖钳夹试验检测；体外研究中INS-1细胞AT1R及胰岛素基因表达采用RT-PCR检测，细胞活性、凋亡及胰岛素信号分子分别采用MTT法、免疫荧光与流式细胞仪及western-blot法检测。结果1．胰岛素抵抗阶段阻断RAS对胰岛β细胞功能的效应及机制，及其对STZ致糖尿病发生率的影响1．1长期高脂高热量饮食喂养大鼠胰岛素敏感性及胰岛β细胞功能与正常对照组（NC，n=15）相比，高脂对照组（FC，n=15）稳态葡萄糖输注率（GIR）显著降低[（7.80±0.51）mg·kg^-1·min^-1 vs（5.32±0.90）mg·kg^-1·min^-1，P＜0.01]，说明FC组出现了明显的胰岛素抵抗；FC组胰岛增生肥大，胰岛内胰岛素相对含量（IRC）较NC组显著降低（P＜0.01），提示FC组大鼠β细胞内胰岛素储备不足；胰岛素阳性细胞核密度（ICD）也有减少趋势，但是差异无统计学意义；葡萄糖负荷后第一时相胰岛素分泌高峰延迟，0-10min胰岛素曲线下面积（AUCI）低于NC组（P＜0.01），但是10-60minAUCI超过NC组68.8％（P＜0.01），提示FC组大鼠胰岛素第一时相分泌不足，而出现第二时相异常高分泌。1．2胰岛素抵抗大鼠胰岛内RAS表达、炎症反应及细胞凋亡与NC组比较，FC组AT1R mRNA相对表达量增加了1.16倍（P＜0.01），白细胞介素1β（IL-1β）相对表达量增加了1.95倍（P＜0.01），核因子κB（NF-KB）相对浓度增加了20.5％（P＜0.01），胰岛内凋亡信号分子Caspase-3相对表达量增加了19.1％（P＜0.01），单位胰岛面积TUNEL阳性细胞数增加了2.43倍（P＜0.01）。1．3阻断RAS对胰岛素抵抗大鼠胰岛β细胞功能的影响药物干预后，培哚普利干预组（FP，n=15）、替米沙坦干预组（FT，n=15）IRC较FC组明显增加，分别为（-4.99±0.12）（P＜0.05）与（-4.87±0.09）（P＜0.01）；ICD也有所增加，但是差异无统计学意义；AUCI（10-60）分别下降了15.6％、17.3％（均P＜0.01），AUCI（0-10）及AUCI（0-60）也有所下降，但差异无显著性。说明阻断RAS具有增加胰岛素抵抗大鼠β细胞内胰岛素含量及部分改善胰岛素分泌模型的的效应。FP组、FT组之间差异均无显著性。1．4阻断RAS对胰岛素抵抗大鼠胰岛内炎症及细胞凋亡的效应与FC组相比，FP组、FT组胰岛内AT1R mRNA相对表达量明显降低（均P＜0.01），IL-1β相对表达量降低了22.4％（P＜0.05）、28.5％（P＜0.01）；NF-KB相对含量分别下降了20.1％、22.8％（均P＜0.01）；Caspase-3相对表达量分别降低了15.5％、17.7％（均P＜0.01）；单位胰岛面积TUNEL阳性细胞数分别下降了60.0％及67.4％（均P＜0.01）。说明阻断RAS可以显著降低胰岛素抵抗大鼠胰岛内炎症反应及细胞凋亡水平。FP组、FT组之间差异均无显著性。1．5在胰岛素抵抗阶段阻断RAS对STZ致糖尿病发生率的影响与高脂+STZ腹腔注射组（FS，n=15）比较，替米沙坦干预+STZ腹腔注射组（TS，n=15）糖尿病的发生率显著降低，分别为80.0％（12／15）、33.3％（5／15）（P＜0.05）。两组平均空腹血糖也有显著差异[（17.5±5.1）mmol／l vs（13.2±4.7）mmol／l，P＜0.05]。2．糖尿病阶段阻断RAS对胰岛β细胞功能的效应及机制2．1高脂饮食加小剂量STZ腹腔注射构建的糖尿病大鼠模型胰岛结构与功能与正常对照组（NC，n=10）相比，糖尿病组（DM，n=8）大鼠胰岛形态不规则，边界模糊，结构紊乱，IRC显著下降（P＜0.01）；胰岛素第一时相分泌高峰延迟、峰值降低，AUCI（0-10）下降了67.0％（P＜0.01），早期胰岛素分泌指数（EISI）降低了81.1％（P＜0.01）。2．2糖尿病大鼠胰岛内RAS表达、氧化应激、微血管密度及细胞凋亡与NC组比较，DM组胰岛内血管紧张素原（AGT）mRNA表达显著增加（P＜0.01）；诱导型一氧化氮合酶（iNOS）相对浓度增加了10.3％（P＜0.01），提示糖尿病状态下胰岛局部氧化应激反应增强；胰岛微血管密度（MVD）降低了71.4％（P＜0.01），低氧诱导因子1α（HIF-1α）mRNA相对表达量增加了1.19倍（P＜0.01），提示糖尿病大鼠胰岛处于相对或绝对乏氧状态；单位面积胰岛细胞凋亡数增加了2.14倍（P＜0.01）。2．3阻断RAS对糖尿病大鼠胰岛β细胞功能的影响药物干预后，ACEI组（AE，n=10）、ARB组（AR，n=10）胰岛结构有所改善，IRC较DM组明显增加（均P＜0.01），AUCI（0-10）分别增加了41.2％和33.1％（均P＜0.01），EISI分别增加了1.84倍和1.74倍（均P＜0.01），说明阻断RAS后糖尿病大鼠胰岛素第一时相分泌有所恢复。AE组、AR组之间差异均无显著性。2．4阻断RAS对糖尿病大鼠胰岛氧化应激、微血管密度及细胞凋亡的影响AE组和AR组胰岛内iNOS含量较DM组分别下降了16.5％、18.2％（均P＜0.01）；MVD分别增加了62.5％（P＜0.05）与75.0％（P＜0.01），HIF-1α基因表达分别下降了27.2％与29.0％（均P＜0.01）；单位面积胰岛凋亡细胞数分别下降了29.0％、36.2％（均P＜0.01）。AE组、AR组之间差异均无显著性。3．RAS参与β细胞功能损害的相关分子机制3．1不同糖浓度处理不同时间INS-1细胞AT1R基因表达变化以5.6 mmol／l的葡萄糖（简称为5.6mG，下同）培养24h作为基础对照组，5.6mG培养48h AT1R mRNA表达无明显改变；16.7mG培养24h后AT1R mRNA表达增多，但差异无统计学意义，培养48h后AT1R mRNA表达较对照组增加了0.72倍（P＜0.05）；33.3mG培养24h，AT1R表达水平较对照组增加了1.33倍（P＜0.01），培养48h后，AT1R mRNA表达水平进一步增加，为对照组的2.6倍（P＜0.01）。3．2不同浓度AngⅡ处理24h对INS-1细胞胰岛素分泌功能的影响以5.6mG培养24h作为对照组，不同浓度（0.1、1、10、100nmol／1）AngⅡ处理组基础状态下的胰岛素分泌无明显改变，但葡萄糖刺激后胰岛素分泌（GSIS）分别较对照组下降了7.9％（P＜0.05）、21.1％（P＜0.01）、26.3％（P＜0.01）和34.2％（P＜0.01）。3．3不同浓度AngⅡ处理24h对INS-1细胞凋亡的影响分组同上，观察INS-1细胞的凋亡率变化。5.6mG培养48h，细胞凋亡率为5.7％，0.1 nmol／l AngⅡ培养24h组细胞凋亡率为10.3％，较对照组增加，但是差异无统计学意义，其余各组（1，10，100 nmol／l）随AngⅡ浓度增加，细胞凋亡率均显著增加（均P＜0.01）。3．4不同浓度AngⅡ处理24h对INS-1细胞胰岛素信号分子的影响以5.6mG培养24h为对照组，未检测到磷酸化的胰岛素受体底物丝氨酸270位点（IRS-ser270）的表达，而加入不同浓度（0.1、100nmol／l）AngⅡ培养24h后，可检测到磷酸化IRS-ser270蛋白表达，其相对表达量分别为0.31，0.72（均P＜0.01）；0.1nmol／l AngⅡ处理24h后，蛋白激酶B丝氨酸473位点（PKB-ser473）磷酸化水平较对照组下降了20.1％（P＜0.01），100nmol／l AngⅡ培养24h后，PKB-ser473磷酸化水平进一步降低，较对照组下降了30.2％（P＜0.01）。结论RAS活化与糖尿病发病进程中胰岛β细胞功能损害密切相关，葡萄糖具有浓度及时间依赖性地上调胰岛RAS活性的效应。RAS活化可能通过诱发胰岛炎症反应、氧化应激、局部血流动力学异常、胰岛素受体后信号通路损害及细胞凋亡等机制损伤β细胞存活与功能。早期阻断RAS具有保护胰岛β细胞功能的作用，可以显著降低胰岛素抵抗大鼠STZ致糖尿病的发生率；在糖尿病阶段阻断RAS，对胰岛β细胞存活与功能仍然具有明显的保护效应。阻断RAS可能通过减轻胰岛炎症反应与氧化应激、改善胰岛微血流及β细胞胰岛素信号通路、减少胰岛细胞凋亡等机制保护或改善胰岛β细胞功能。