白花蛇舌草(Hedyotis diffusa Willd.)是茜草科(Rubiaceae)耳草属(hedyotis L)植物白花蛇舌草的干燥全草,收载于2010年版《中国药典》一部附录三(成方制剂中本版药典未收载的药材及炮制品)中,具有清热解毒、利尿消肿等功效,临床疗效确切。前期物质基础研究表明,黄酮和有机酸是白花蛇舌草中抗肿瘤的有效部位,目前对白花蛇舌草有效部位的制备工艺研究很少。本研究制定了白花蛇舌草有效部位的制备工艺,并对有效部位中间体进行质量标准的初步研究。目的对临床常用的抗肿瘤中药白花蛇舌草进行深入研究,分离纯化其抗肿瘤有效部位(黄酮和有机酸);对有效部位中有效成分进行定量分析,并建立有效部位指纹图谱,为制定有效部位中间体的质量标准提供参考。方法1.利用分光光度法,分别建立白花蛇舌草中总黄酮、总三萜酸、总苯丙素类有机酸(苯丙酸)的含量测定方法。2.分别考察甲醇超声提取、碱水回流提取、乙酸乙酯回流提取和乙醇回流提取法对白花蛇舌草有效部位提取效果的影响,优选最佳提取方法。以药材有效部位提取率为指标,采用单因素考察影响白花蛇舌草总黄酮和总有机酸的提取因素,采用L9(34)正交实验考察提取溶剂的浓度、用量、提取次数和提取时间四个因素对白花蛇舌草总黄酮和总有机酸的提取效果,确定最佳工艺条件。3.以白花蛇舌草有效部位(总黄酮和总有机酸)含量为指标,通过静态吸附与解析率的考察,优选纯化白花蛇舌草有效部位的最佳树脂;以优选的树脂为媒介,分别单因素考察富集有效部位的各个相关参数,制定最佳纯化工艺。4.采用紫外-分光光度法对白花蛇舌草有效部位中总黄酮和总有机酸进行含量测定;借助高效液相色谱(HPLC)分别建立了对-香豆酸、芦丁的含量测定方法;采用建立的含量测定方法,对五个产地白花蛇舌草进行质量分析;单因素考察了色谱柱、流动相系统、检测波长和柱温等对样品分离的影响,建立有效部位中间体的指纹图谱。结果1.总黄酮的含量测定方法:利用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色法测定样品在510 nm处的吸收值;总三萜酸的含量测定方法:利用香草醛-冰醋酸-高氯酸显色法测定样品在550 nm处的吸收值;总苯丙酸的含量测定方法:直接测定样品于320nm处的吸收值。方法学考察结果表明,三种方法测量结果准确,重现性好,适用于样品的含量测定。2.选择乙醇回流提取法作为白花蛇舌草有效部位的提取方法。采用L9(34)正交实验考察提取乙醇浓度、乙醇用量、提取次数和提取时间四个因素对提取白花蛇舌草总黄酮和总有机酸的影响,确定最佳工艺条件为:取白花蛇舌草药材粗粉,加10倍量70%乙醇回流提取1h,过滤,药渣加8倍量70%乙醇回流提取1h,合并滤液,减压回收乙醇即可。3.选择HPD-826大孔吸附树脂作为纯化白花蛇舌草有效部位的最佳树脂;以HPD-826树脂为媒介,分别单因素考察了富集有效部位时的各个相关参数,确定最佳纯化工艺条件:(1)上样液的制备:取白花蛇舌草提取液,回收乙醇至无醇味,用5%的氢氧化钠调pH至12～14,3000 rpm离心20 min,取上清液,用5%盐酸调pH至2～3,3000rpm离心20min,取沉淀,水溶解成混悬液,定容至0.4g·mL-1,即得上样液;(2)树脂纯化工艺条件:取上样液,调节pH至5.0,按0.6 g-mL-1上样量上样,静置吸附1 h,去离子水洗,至流出液无色,用经氨水调pH至7的70%乙醇洗脱.根据黄色色带收集洗脱液,至黄色色带全被洗脱出来即可。具体纯化参数为:选择上样液pH值为5,上样量0.6 g·mL-1树脂,上样液浓度0.4 g·mL-1,上样流速1.5～2BV·h-1,洗脱流速1.5～2BV·h-1,洗脱液pH用氨水调至7,洗脱醇浓度70%。以此方法富集得到的有效部位含量达到50%以上。4.建立了对-香豆酸、芦丁的高效液相(HPLC)含量测定方法,方法学考察结果良好,目标成分与相邻杂质峰的分离度达到1.5以上,建立的两种方法快速、灵敏、准确:以有效部位含量为评价指标对五个不同产地的白花蛇舌草药材质量进行分析,结果表明,广东、广西来源的药材质量较好,湖南来源的药材质量略差,江西、河南来源的药材质量较差;指纹图谱实验结果表明,对十批不同产地来源的白花蛇舌草制备所得的有效部位进行分析,共获得14个较为明显的特征峰,以对-香豆酸(6号色谱峰)作为参照峰,采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统研究版2004A软件计算十批白花蛇舌草中间体的相似度,十批白花蛇舌草有效部位中间体的指纹图谱具有较好的相似性,各批次的相似度均高于0.9,说明所建立的指纹图谱方法可行,所制备的样品质量良好,为有效部位中间体的质量评价提供参考。结论本课题以总黄酮和总有机酸为目标部位对白花蛇舌草抗肿瘤有效部位制备工艺和质量标准进行研究,制定了白花蛇舌草有效部位的最佳制备工艺,以该工艺制备的有效部位中有效成分含量不低于50%,工艺操作简单,经济合理,稳定可行。建立了有效部位中指标性成分的含量测定方法,分析方法快速、灵敏、准确,重现性好;建立了有效部位中间体的指纹图谱,为有效部位中间体的质量评价提供重要参考。本课题研究成果具有一定的学术价值和应用开发前景,对开发新的白花蛇舌草有效部位制剂及其产业化具有重要意义。