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microRNAs(miRNAs)是一类长为20-25核苷酸的非编码RNA,它们是由带有发夹结构的前体miRNA剪切而成。miRNA代表了一类崭新的ncRNA,其通过3’非翻译区(3’UTRs)的反义序列与靶mRNA互补配对,从而特异性地调控靶基因的表达。随着对miRNA在发育调控、细胞增殖和凋亡、造血过程等方面作用研究的不断深入,人们认识到miRNA在动植物体内发挥着非常广泛而重要的调控作用,尤其是miRNA与哺乳动物造血细胞系的分化、造血过程以及血液系统疾病密切相关。同时,细胞凋亡诱导剂作为癌症治疗药物日益受到重视,在天然产物中寻找细胞凋亡诱导剂也成为国际研究的热点。本实验通过筛选众多的药物,选出了天然药物姜黄素(Curcumin)和冬凌草甲素(Oridonin)作为研究对象。文献表明这两种药物在诱导细胞凋亡方面效果显著,并且其诱导凋亡的分子机制被阐明得较为清楚:它们具有免疫调节、抗炎作用,可诱导Jurkat和HL.60细胞的凋亡:其诱导凋亡的机制与端粒酶活性下降及凋亡相关因子的表达水平下调有关。
本实验运用诱导细胞凋亡的方法,通过设置时间和浓度梯度,确定了姜黄素和冬凌草甲素对Jurkat和HL-60的效应时间和效应浓度。并用形态学和台盼蓝,DAPI染色的手段对凋亡参数进行了分析。形态学观察表明,凋亡的细胞均会出现核质皱缩和凋亡小体。细胞凋亡率和细胞数目的曲线表明姜黄素和冬凌草甲素对Jurkat和HL-60细胞的生长均具有明显的抑制作用。Jurkat细胞对两种诱导剂的反应较为敏感。在一定作用时间和剂量范围内,这种抑制作用具有时间效应和剂量效应。本实验也证明了DMSO作为一种有机溶剂,在低浓度下(<0.1﹪)不会对细胞产生诱导凋亡的作用。
在此基础上,本实验利用反式杂交和计算机分析的手段比较凋亡前后Jurkat和HL-60的microRNA表达量的变化情况。我们合成82个与miRNA互补的oligoDNA交联在杂交膜上,然后标记样品RNA进行杂交,高通量检测特定9个样品中miRNA的表达情况。通过Imagequant和GeneSpring7.2进行统计分析和作图,发现部分miRNA在不同状态的白血病细胞中存在着表达差异,表现在:Jurkat和HL-60两细胞株之间的差异:姜黄素和冬凌草甲素分别作用导致的差异;同一诱导剂作用时间长短和浓度高低所导致的差异。并且大部分miRNA上调,小部分下调。个别上调分子经t检验,P值<0.05,差异显著。通过分析差异表达的miRNA潜在靶基因,暗示了这些小分子可能参与了姜黄素和冬凌草甲素诱导白血芮细胞凋亡的过程。由于本实验第一次将天然药物姜黄素、冬凌草甲素与miRNA联系起来,并将其运用于血液系统肿瘤的研究,因此可以进一步阐明此两种药物的诱导凋亡机制;也有助于发现更多与血液肿瘤相关的miRNA。