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目的：在离体培养的新生大鼠心室肌细胞中,观察自吞噬现象对于心肌细胞Cx43(Connexin43)表达的调节作用；建立两种以心律失常为主要症状的疾病模型：HSV-1病毒性心肌炎体外细胞模型和短时程室性心动过速体外细胞模型,观察两种疾病模型中Cx43的动态变化,以及自吞噬现象对于Cx43的调节作用；同时尝试以自吞噬为治疗靶点,观察自吞噬靶向治疗对于这两种疾病在电生理方面的疗效。方法：1.离体培养新生大鼠的心室肌细胞：采用“反复胰酶消化法”离体培养新生大鼠的心室肌细胞(Isolation of Neonatal Rat Ventricular Myocytes, NRVM)。1-3天龄的新生SD大鼠,麻醉处死后,开胸取出大鼠心脏,于37℃下以0.05%胰酶反复消化。差异贴壁法去除成纤维细胞等混杂成分。镜下观察细胞收缩,以及免疫荧光检测细胞的a-actin,以此鉴定心室肌细胞纯度。2.构建两种以心律失常为主要症状的疾病模型,即HSV-1病毒性心肌炎体外细胞模型和短时程室性心动过速体外细胞模型：(1)HSV-1病毒性心肌炎体外细胞模型：野生型HSV-1病毒(McKrae毒株)经Vero细胞扩增后,以1.0 PFU的滴度感染离体培养5天左右的原代新生大鼠心室肌细胞,感染后24h显微镜下观察靶细胞的细胞病变现象(the cytopathic effects, CPE),并以Western Blot检测靶细胞中病毒HSV-1 gD蛋白的表达。(2)短时程室性心动过速体外细胞模型：离体培养5天左右的原代新生大鼠心室肌细胞,以电刺激仪予以连续的快速电场刺激(Rapid Electrical Field Stimulation, RES),输出电压为5.0V/cm,频率为5Hz,电刺激时间30min至24h不等,刺激强度设定以镜下可见细胞收缩频率较未刺激时明显加快为准。3.通过药物增强／抑制心肌细胞的自吞噬,在这两种体外细胞模型中观察自吞噬活性对Cx43表达和功能的影响：以雷帕霉素(rapamycin)作为自吞噬促进剂,以3MA (3-methyladenine)作为自吞噬抑制剂,以上两种药物分别增强和抑制上述疾病模型中的自吞噬活性,并以此观察下游Cx43的表达及功能。Western Blot检测LC31/2, Atg5, Beclin-1等自吞噬活性相关蛋白,以及缝隙连接蛋白Cx43的表达；免疫荧光检测心肌细胞中Cx43的表达及分布；荧光黄划痕实验检测心肌细胞Cx43的信号传递功能；同时以real-time PCR检测心肌细胞中Cx43.L型钙通道以及HSV-1 gD的mRNA表达水平。4.初步探索自吞噬上游相关信号通路的变化：采用Western Blot方法检测室性心动过速疾病模型在自吞噬改变的情况下,其自吞噬上游信号通路中关键分子的表达改变,如Akt信号通路中的p-Akt和mTOR信号通路中的p-S6K,通过观察信号通路的改变初步探索自吞噬调节Cx43的相关机制。结果：1.成功分离培养原代的新生大鼠心室肌心肌细胞,镜下可见细胞搏动一致性好,免疫荧光检测a-actin证实细胞为心肌细胞；2.WB检测证实,在心室肌细胞中,自吞噬活性与Cx43的表达相关,自吞噬增强可以增进Cx43降解从而降低其表达水平,相反的,自吞噬活性降低可以提高Cx43的表达水平：3. HSV-1 gD的WB结果及镜下CPE证实HSV-1可以有效感染NRVM, HSV-1病毒性心肌炎模型建立成功,且Cx43的WB及IF结果显示,HSV-1可降低NRVM中的Cx43表达水平；4. NRVM经RES电场刺激后,Cx43和L-钙通道的WB结果显示,Cx43表达呈动态改变,L-钙通道表达降低,短时程室性心动过速细胞模型建立成功；5.荧光黄划痕实验结果显示,雷帕霉素可以通过减少HSV-1病毒性心肌炎模型中病毒滴度从而增强Cx43的信号传导功能,而3MA则相反,虽增加了Cx43的蛋白累积,但是对病毒感染无效果,且增多的Cx43多为无信号传导功能的蛋白；6. p-Akt和p-S6K的WB结果显示,快速电场刺激是通过对于白吞噬上游Akt/mTOR信号通路的调节来改变细胞内自吞噬水平,从而调节NRVM的Cx43表达。结论：1.在新生大鼠心室肌细胞中,自吞噬可以调节Cx43水平,自吞噬增强则Cx43水平降低,自吞噬抑制则Cx43蛋白累积；2.在HSV-1心肌炎细胞模型中,自吞噬增强可下调病毒滴度,从而改善HSV-1所导致的Cx43功能不良,而自吞噬抑制虽然能够使得Cx43蛋白累积,但其所聚集的Cx43无信号传导功能；3.在短时程室性心动过速细胞模型中,快速电场刺激可以通过对于自吞噬活性的调节,动态调节靶细胞Cx43的表达；4.对于自吞噬活性的调节,都通过调节自吞噬上游信号通路,即Akt/mTOR信号通路的信号转导而实现的。