MPEG-PLLA-PTMC/ZNS-PDN纳米胶束治疗大鼠急性脊髓半切损伤的实验研究

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目的:(1)制备甲氧基聚乙二醇-左旋聚乳酸-聚三亚甲基碳酸酯/唑尼沙胺-泼尼松(MPEG-PLLA-PTMC/ZNS-PDN)纳米胶束新型药物制剂,并对其理化性质进行探究。(2)研究新型药物制剂MPEG-PLLA-PTMC/ZNS-PDN纳米胶束在体外的抗氧化应激作用及对大鼠神经元细胞轴突生长的影响。(3)研究新型药物制剂MPEG-PLLA-PTMC/ZNS-PDN纳米胶束在SD大鼠脊髓半横断损伤中的治疗作用。方法:(1)通过催化剂作用下的开环聚合反应合成MPEG-PLLA-PTMC聚合物,采用薄膜水化法制备MPEG-PLLA-PTMC/ZNS-PDN纳米胶束,并通过粒度仪对其粒径进行测试;同时采用透射电镜观察其物理形貌。冻干后行1H-NMR、FT-IR、XRD,对其化学结构进行分析。通过载药量、包封率和体外释放实验对其载药能力、体外缓释效果进行研究。(2)培养大鼠胶质细胞系CTX TNA2,H2O2处理后建立体外氧化应激细胞损伤模型。分别以不同浓度泼尼松(PDN),唑尼沙胺(ZNS)以及泼尼松-唑尼沙胺双药等比例混合(ZNS-PDN)处理氧化应激损伤后的CTXTNA2细胞,通过不同时间点MTT实验验证各组药物抗氧化应激效应,并确定最佳药物浓度。再次建立CTXTNA2体外氧化应激细胞模型,分别以等药物浓度的ZNS-PDN,MPEG-PLLA-PTMC/ZNS-PDN纳米胶束,空载MPEG-PLLA-PTMC胶束和二甲亚砜(DMSO)处理细胞,并通过MTT实验验证各组材料抗氧化应激效应。无菌条件下培养大鼠胚胎神经元原代细胞,分别以等药物浓度游离ZNS-PDN,MPEG-PLLA-PTMC/ZNS-PDN纳米胶束,空载MPEG-PLLA-PTMC胶束处理细胞,1周后观察细胞轴突生长情况,同时采用免疫荧光染色观察神经元细胞MAP-2特异性表达情况。(3)建立60只雄性SD大鼠脊髓损伤模型,于T9、T10棘突位置打开椎管分离暴露脊髓并对脊髓行半横断,建模成功后随机分为假手术组、对照组、游离ZNS-PDN治疗组、MPEG-PLLA-PTMC/ZNS-PDN纳米胶束治疗组以及MPEG-PLLA-PTMC空载纳米胶束治疗组,每组12只;术后6小时和第4天按上述分组分别给予相同载药剂量尾静脉注射。于术后1天、1周、2周、1月、2月、3月采用BBB评分对各组大鼠损伤侧后肢运动功能进行评分。于术后7d、1M进行脊髓MRI检查,观察脊髓损伤愈合情况;于术后7d、14d、1M点取脊髓损伤部位组织,固定后进行石蜡包埋切片,HE染色及免疫组化染色(NF、GFAP、Nrf2、Tunel)观察损伤部位病理学变化;同时取对照组及MPEG-PLLA-PTMC/ZNS-PDN纳米胶束治疗组大鼠各主要器官组织,通过HE染色观察MPEG-PLLA-PTMC/ZNS-PDN纳米胶束是否存在体内毒性反应。结果:(1)1H-NMR分析结果显示分子量为3900的MPEGPLLA-PTMC成功合成。粒径、电位结果显示MPEG-PLLA-PTMC/ZNS-PDN纳米胶束平均粒径分别为50nm。FT-IR、XRD、DSC结果显示ZNS-PDN成功载入MPEG-PLLA-PTMC纳米胶束中。通过HPLC测得MPEG-PLLA-PTMC/ZNS-PDN纳米胶束具有较高的载药量和包封率。体外缓释实验显示,相对于游离ZNS-PDN,MPEGPLLA-PTMC/ZNS-PDN纳米胶束具有良好的体外缓释效果。(2)游离PDN,ZNS及等比例混合的ZNS-PDN在10μM-30μM浓度范围内均能在体外发挥抗氧化应激作用,且ZNS-PDN双药具有协同作用。同时,与相同浓度游离ZNS-PDN相比,MPEG-PLLA-PTMC/ZNS-PDN纳米胶束在体外能够发挥类似效果的抗氧化应激作用。此外,经游离ZNS-PDN以及MPEG-PLLA-PTMC/ZNS-PDN纳米胶束处理的原代神经元细胞,与对照组相比,7天后能够观察到更长的轴突以及更多的突触形成数目。(3)术后2周MRI发现,除对照组为T1低信号外,各组MRI伤口开始愈合;1月MRI发现胶束包载双药组在脊髓损伤部位伤口愈合,空胶束组及双药组部分愈合。术后7d、14d脊髓损伤部位HE染色见有不同程度的白质、灰质完整性的破坏,神经纤维断裂以及神经细胞的死亡,同时继发有损伤周围细胞死亡、以及神经纤维的裂解,在空洞周围伴有有少量的胶质细胞增生,30d组发现双药及游离药物组损伤愈合较对照组好,胶质瘢痕少于对照组;术后7d、14d、30d对各组脊髓组织进行免疫组织化学染色,观察损伤部位Neurofilament-H(NF),GFAP等相关蛋白表达情况,其结果显示MPEG-PLLA-PTMC/ZNS-PDN纳米胶束治疗组较其它各组有更高的NF表达量,GFAP减少(P<0.05);Nrf2表达在7d、14d表达增高于其他组(P<0.05),30d无统计学意义(P>0.05);Tunel染色发现各时间点纳米双药组表达均比其它组凋亡减少(P<0.05)。BBB评分结果显示,除术后1天外各时间点MPEG-PLLA-PTMC/ZNS-PDN纳米胶束治疗组大鼠BBB评分均高于其它各治疗组,且具有统计学差异(P<0.05)。结论:(1)本研究成功制备了MPEG-PLLA-PTMC/ZNS-PDN纳米胶束,具有较稳定的理化特性和体外缓释效果。(2)MPEG-PLLA-PTMC/ZNS-PDN纳米胶束在体外能够有效发挥抗氧化应激损伤效应,同时能促进大鼠神经元原代细胞轴突生长。(3)MPEG-PLLAPTMC/ZNS-PDN纳米胶束静脉注射治疗对大鼠脊髓半横断损伤具有一定的神经修复作用。
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