真菌感染是对人与动物危害最严重的人畜共患病之一,已知大约100种真菌对人和动物是具有致病性的。机会性和侵袭性真菌感染已经成为免疫缺陷病人(如HIV、癌症患者和器官移植病人)发病和死亡的主要原因[1-4]。在过去几十年里,真菌发病率以惊人的速度增长。据报道,系统性真菌感染的病死率超过30%[5-71。目前临床常用的抗深部真菌药物是唑类和两性霉素B。原发性和机会性致病真菌不断出现耐药以及药物对宿主的毒性问题使临床迫切需要开发新的抗真菌药物[8-121。棘白菌素类药物属于脂肽抗真菌药物,通过非竞争性抑制真菌细胞壁(1,3)-β-D-葡聚糖合成酶,葡聚糖合成酶是保持真菌细胞壁完整性的必要成分[13]。由于哺乳动物没有细胞壁,故该类药对人体的毒性较低,副作用较少。与其它抗真菌药物相比,棘白菌素类药物不易产生耐药且没有药物-药物相互作用[14],是目前一种重要的治疗严重深部真菌感染药物[15]。阿尼芬净属于第三代棘白菌素类的半合成抗真菌药,对所有念珠菌,包括对唑类和多烯类耐药的念珠菌属,具有较强的杀菌作用,同时对曲霉菌也有一定的抑制作用[16,17]。然而阿尼芬净溶解性较差,临床使用需要毒性较大的增溶剂(如:吐温80等),临床每天给药成本较高,这在一定程度上限制了其临床应用[18]。改善水溶性并延长其半衰期的各种策略广泛应用于阿尼芬净的结构改造。BG40018是对阿尼芬净结构修饰而得到的发酵半合成棘白菌素类药物,通过抑制真菌细胞壁(1,3)-β-D-葡聚糖合成酶而发挥抗真菌作用。本课题对BG40018的体外活性、体内活性、药代动力学特征和安全性进行研究,为BG40018的使用和进一步开发提供理论依据。1.BG40018体外抗真菌活性研究为研究BG40018对酵母菌和霉菌的体外抗真菌活性。按照临床和实验室标准品研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute)M38-A2 和 M27-A3 文件所述程序对BG40018体外抗念珠菌属的最低抑菌浓度(MIC)进行了测定,同时以阿尼芬净为对照药物。药物经倍比稀释至指定浓度范围,RPMI 1640培养液加入吗啉基丙磺酸(MOPS)并调节pH至7.0,起始接种浓度为0.5×103～2.5×103 CFU/mL。念珠菌微量滴定板在孵箱中35℃培养24 h后读取MIC值,新生隐球菌培养72 h后读取MIC值。MIC值判定为肉眼观察到相当于生长对照有50%生长减少时的最低药物浓度。结果表明:BG40018对念珠菌的MIC值≤0.125μg/mL,BG40018和阿尼芬净的活性相当,MIC值差距在2个梯度以内。两者对新生隐球菌和曲霉菌的体外抗真菌活性较弱。以上结果表明BG40018对氟康唑敏感和耐药的念珠菌包括光滑念珠菌和克柔念珠菌均有较强的抗真菌活性,活性与阿尼芬净相当。2.BG40018体外抗真菌的时间-效应关系研究通过时间-杀菌曲线实验进一步确认BG40018抗真菌活性以及作用的时效特点。将白色念珠菌SC5314,热带念珠菌ATCC20026,克柔念珠菌ATCC2340和新生隐球菌H99菌悬液稀释至1×105CFU/mL,加入2μg/mL的BG40018或阿尼芬净,35℃振荡培养,分别于0、4、8、12、16和24 h,所有菌液中各取100 μL液体,以去离子水梯度稀释,从各时间点菌液中各取100 μL均匀涂铺于SDA固体培养基表面。35℃培养48 h后计数菌落数目。结果表明:BG40018和阿尼芬净对白色念珠菌SC5314、克柔念珠菌ATCC2340和热带念珠菌ATCC20026均具有较强的抑菌作用,BG40018处理24 h后的菌落总数比阿尼芬净处理的下降了 0.8～1.1 Log10 CFU/mL。两种药物对新生隐球菌H99抑菌效果较弱,但BG40018处理24 h后的菌落总数与阿尼芬净相比下降了 0.4 Log10 CFU/mL,表明BG40018体外抗杀菌速率略好于阿尼芬净。3.BG40018在小鼠体内的抗真菌活性研究为比较BG40018和阿尼芬净对系统性白色念珠菌SC5314感染小鼠体内抗真菌活性。在给药前第4和第1 d,腹腔注射150 mg/kg环磷酰胺诱导小鼠产生免疫缺陷。给药前2 h尾静脉注射1×104CFU/只(0.1mL)白色念珠菌SC5314建立系统性真菌感染模型。感染2 h后单次尾静脉给予0.5、1.5和4.5 mg/kg的BG40018或阿尼芬净溶液;给药24 h后,处死小鼠后,取右侧肾脏加入PBS匀浆,匀浆液涂铺于SDA固体培养基表面,于35℃真菌培养箱中培养48 h后计数菌落数目。左侧肾脏经由10%中性福尔马林液中固定,切片后进行HE染色和PAS染色。在另一实验中,小鼠感染2 h后尾静脉注射1.5 mg/kgBG40018或阿尼芬净溶液,模型组于感染2h后尾静脉给予生理盐水。给药后每天观察小鼠死亡情况,共观察25天,计算存活百分率和中位生存期。结果表明:给药24 h后,BG40018和阿尼芬净在0.5 mg/kg剂量水平对系统性真菌感染小鼠抗真菌活性稍弱,1.5和4.5mg/kg均可显著降低系统性真菌感染小鼠的肾脏载菌量,其中BG40018抗真菌活性略优于阿尼芬净。PAS染色结果显示:与感染对照组相比,BG40018和阿尼芬净均可显著降低肾脏中菌丝态白色念珠菌。HE染色结果表明:与阿尼芬净组相比,BG40018处理小鼠肾脏损伤略有改善。生存率实验中,对照组小鼠在系统性真菌感染后3d全部死亡,BG40018组小鼠在感染后25d仅个别动物死亡。BG40018组生存率与等剂量阿尼芬净组相比显著提高。对照组小鼠中位生存期为2天,BG40018组和阿尼芬净组小鼠中位生存期分别为>25和24.5天。上述结果表明:在系统性真菌感染小鼠中,与阿尼芬净相比,BG40018在降低肾脏载菌量、改善肾脏病变和提高生存率等方面表现出更好的活性。4.BG40018在比格犬体内药代动力学研究为研究BG40018和阿尼芬净静脉给药后在比格犬体内的药代动力学特征。将实验比格犬经静脉推注给予1 mg/kg BG40018或阿尼芬净,使用K2 EDTA抗凝管从颈静脉最长至给药后72h,4℃离心分离血浆,低于-70℃保存。用LC-MS/MS方法分析血浆中BG40018或阿尼芬净浓度。乙腈沉淀血浆蛋白后从基质中提取BG40018或阿尼芬净,随后以去离子水进行液液萃取。利用Agilent ZORBAX EclipseXDB-C18(50×2.1 mm,3.5 μm)或SB-C18(50×2.1 mm,5 μm)色谱柱,在室温进行梯度洗脱,流动相为水(0.1%甲酸)和乙腈:水=95:5(含0.1%甲酸),流速为0.4mL/min。采用API4000(Applied Biosystems)ESI正离子化方式检测,扫描方式为多反应监测(MRM),用于定量分析的离子对为 BG40018:m/z 1217.2→104.1(IS:m/z 455.2→165.1);阿尼芬净 m/z 1140.7→→343.3(IS:m/z 494.2→369.1),采用WinNonlin软件非房室模型计算药动学参数。结果表明:经静脉10 min推注后,BG40018在体内清除缓慢(CL=0.208 mL/min/kg,t1/2=51 h),AUC0-inf和Vdss分别为80730 ng·h/mL和0.794 L/kg。阿尼芬净在体内清除较快(CL=0.748 mL/min/kg,t1/2=17 h),AUC00-inf和 Vdss 分别为 22396 ng.h/mL 和 0.835 L/kg。这说明与阿尼芬净相比,BG40018的半衰期显著延长,有利于提高系统暴露量。5.BG40018对SD大鼠的重复给药毒性研究为评价BG40018连续给药对SD大鼠的安全性。将实验SD大鼠(5/性别/组)尾静脉14d连续注射给予BG40018(0、10、20和40 mg/kg)或阿尼芬净(40 mg/kg),评价药物对临床症状、体重、血液常规、血液生化、血凝、尿液检查、剖检和肉眼观察、脏器重量和组织病理学检查的影响。结果表明:BG40018各剂量组动物在临床症状、体重、血液学、血清生化、血凝、尿液分析、主要脏器大体观察、脏器系数和病理学检查中未发现明显变化。阿尼芬净组则表现出体重降低,RBC、HGB、HCT、MCV、MCHC、PLT、MPV和RET#呈降低趋势,AST和ALT显著升高,剖检主要可见肝脏肿大,镜检可见肝细胞肥大和单个肝细胞坏死,其他脏器无明显变化。根据文献:阿尼芬净在大鼠体内最高非致死剂量为50mg/kg,相当于治疗食道念珠菌感染推荐剂量(50mg/day)的10倍或念珠菌血症以及其它念珠菌感染推荐剂量(100 mg/day)的5倍(根据体表面积折算),大鼠毒性实验观察到肝脏毒性包括单个肝细胞坏死,肝细胞肥大和肝脏重量增加,推测由于其化学不稳定性,产生潜在的毒性代谢产物。本实验阿尼芬净的毒性特征与文献报道一致,而BG40018(最高剂量40mg/kg)连续给药2周未见明显的肝脏毒性。总之:BG40018体外抗菌活性与阿尼芬净相当,体内比阿尼芬净具有更好的药效。与阿尼芬净相比,BG40018具有更优的药代动力学特征和更好的安全性。实验结果支持BG40018作为一种长效的治疗严重威胁生命的真菌感染候选药物,其临床应用需进一步研究。