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目的:β淀粉样蛋白(β-Amyloid,Aβ)是阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的特征性病理改变之一,线粒体自噬受损会导致受损线粒体的堆积,这个过程是Aβ形成的重要原因。线粒体自噬是一种选择性自噬机制,其机制是通过清除受损的线粒体来维持机体的稳态。Valinomycin(缬氨霉素)可以通过诱导线粒体膜电位的降低来激活PINK1/Parkin参与的线粒体自噬通路。但是,Valinomycin通过线粒体自噬途径对Aβ产生的影响还有待更加深入的研究。因此,本研究拟在AD的经典体外模型N2a/APP695swe细胞中,首先使用电镜观察细胞中线粒体的变化,并检测细胞中线粒体自噬相关蛋白的变化;再检测Valinomycin在N2a/APP695swe细胞中通过激活线粒体自噬引起的线粒体相关蛋白和线粒体自噬的变化;进一步检测缬氨霉素引起的线粒体自噬对Aβ含量和ATP水平产生的影响;最后用气相色谱-质谱(GC-MS)联用法对Valinomycin在N2a/APP695swe细胞中引起的ATP相关代谢物的变化进行筛选和分析。本实验旨在对Valinomycin通过诱导线粒体自噬降低Aβ含量和恢复ATP水平的机制进行探索,为寻找与ATP相关的治疗AD的代谢靶点提供了更多理论依据。方法:首先将细胞分为两组:WT组(N2a/WT细胞)和APP组(N2a/APP695swe细胞),用免疫荧光标记法和Western Blot检测稳定转染细胞系N2a/APP695swe细胞中APP的含量;用电镜观察细胞中线粒体结构的改变;同时用Western Blot检测两组细胞中线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin和LC3Ⅱ,以及线粒体标记蛋白Tom20的水平;用ELISA检测各组细胞的培养液中Aβ1-40和Aβ1-42的表达。CCK8(Cell Counting Kit-8)筛选出Valinomycin的最佳作用浓度和作用时间后,在N2a/APP695swe细胞中加入固定浓度(1μM)的Valinomycin。实验分为五组:APP组(N2a/APP695swe细胞)、DMSO组(DMSO处理的N2a/APP695swe细胞)、Va-3h组(Valinomycin处理N2a/APP695swe细胞3 h)、Va-6h组(Valinomycin处理N2a/APP695swe细胞6 h),Va-12h组(Valinomycin处理N2a/APP695swe细胞12 h)。再次用Western Blot检测PINK1、Parkin、LC3Ⅱ和Tom20的表达;选择免疫荧光标记法检测每组细胞中LC3和Tom20的共定位表达所代表的线粒体自噬事件;用光化学分析法检测五组细胞中ATP水平的变化;再次用ELISA检测各组细胞的培养液中Aβ1-40和Aβ1-42含量的变化;最后选择气相色谱-质谱(GC-MS)联用法分析五组细胞中ATP相关代谢物的变化。结果:电镜结果显示,与WT组相比,APP组中的线粒体明显水肿、增大,嵴消失。Western Blot检测发现PINK1、Parkin和LC3II在APP组中的表达均减少(p=0.0004,p<0.0001,p=0.0081),Tom20无明显变化;ELISA检测发现,与WT组相比,APP组中Aβ1-40和Aβ1-42的含量显著增加(p<0.0001,p<0.0001);Western Blot检测发现,与N2a/APP695swe细胞相比,PINK1、Parkin的表达在Valinomycin分别处理N2a/APP695swe细胞3 h时(p=0.0119;p=0.2706)开始上升并持续至6 h(p=0.0025;p=0.0972),在12 h(p=0.0013;p=0.6132)时虽然有所下降,但仍高于APP组和DMSO组;Western Blot检测还显示LC3II在Valinomycin处理后的N2a/APP695swe细胞中的表达从3 h持续增加至12 h(p=0.0231;p=0.0007;p=0.0002),Tom20的表达从3 h持续下降至12 h(p=0.5395;p=0.0734;p=0.0061);免疫荧光共定位检测显示在Valinomycin处理后的N2a/APP695swe细胞中,LC3和Tom20的荧光共定位所代表的线粒体自噬水平从Valinomycin处理3 h后开始增加并持续至12 h(p<0.0001;p<0.0001;p=0.0079);ELISA检测发现,Va-3 h组中Aβ1-40的含量下降,Va-6 h和Va-12 h组虽然增加,但均低于APP组和DMSO组(p=0.0002;p=0.0425;p=0.2467),Va-3 h组、Va-6 h组和Va-12 h组中Aβ1-42的含量也呈相同趋势(p=0.0007;p=0.0721;p=0.3650);化学发光法检测ATP提示ATP的含量从Valinomycin处理3 h组(p=0.0003)开始上升,6和12 h组(p<0.0001;p<0.0001)虽然下降,但均高于APP组和DMSO组;GC-MS联用法分析结果显示,与ATP产生途径相关的代谢物Pyruvic acid(丙酮酸),Citric acid(柠檬酸),Malic acid(苹果酸)和Fumaric acid(延胡索酸)均在Va-3 h组明显增高(p-value&q-value<0.05),同时抗氧化物Glutathione(谷胱甘肽)和Nicotinic acid(烟酸)在Va-3 h组也明显升高(p-value&q-value<0.05)。结论:AD的体外模型——N2a/APP695swe细胞中线粒体及其自噬水平均受损,Aβ1-40和Aβ1-42含量升高。Valinomycin激活N2a/APP695swe细胞中的线粒体自噬后,Aβ1-40和Aβ1-42的水平先下降后上升,而ATP的水平先上升后下降,与ATP相关代谢物的水平先上升后下降。以上结果说明,使用Valinomycin激活N2a/APP695swe细胞中的线粒体自噬时,线粒体自噬的激活程度应处于适当的水平(Valinomycin激活N2a/APP695swe细胞3 h)才能有效降低Aβ的含量和恢复ATP的水平,否则过度激活线粒体自噬(Valinomycin激活N2a/APP695swe细胞6-12 h)会导致Aβ含量的再次升高和ATP水平再次下降的负面作用。总之,本研究为在AD中通过Valinomycin激活线粒体自噬降低Aβ和恢复ATP的水平,以及为寻找与ATP相关的治疗AD的代谢靶点提供了更多的实验依据。