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尽管目前大分割放疗(hypofractionated radiotherapy,HFRT)治疗早期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者取得令人瞩目的疗效,但仍有10%-38%的患者存在局部和/或区域复发,亟待需要明确HFRT抵抗的分子生物学机制,为进一步提高HFRT疗效提供新思路、新方法及新靶点。目前,肿瘤专家分别从Weinberg RA教授总结的肿瘤十大特征入手进行基础及临床研究,寻找干扰肿瘤侵袭转移与发生发展的策略,从而提高肿瘤的治疗效果。其中,肿瘤细胞死亡抵抗及肿瘤新生血管形成是肿瘤发生发展的两大重要特征,也是肿瘤对放化疗抵抗的常见原因之一。放疗后细胞可发生多种死亡方式包括凋亡、坏死及自噬等,其中凋亡抵抗是影响放疗疗效的重要原因之一,但既往针对放疗凋亡抵抗的研究成果临床获益甚少,亟需探索细胞其他死亡方式的在放疗中发挥的作用,从而发掘改善放疗抵抗的新方法。另外,放疗会损伤肿瘤血管内皮细胞减弱局部血管形成,而依赖血管发生途径形成的新生血管,促进肿瘤再生长。明确放疗后血管发生的潜在机制,从而靶向放疗后血管发生过程,可能是抑制肿瘤复发的有效策略之一。本课题前期研究发现:一方面HFRT主要诱导NSCLC细胞程序性坏死,所以亟待研究肿瘤细胞程序性坏死在HFRT抵抗中的作用;另一方面,HFRT可促进内皮细胞凋亡及间充质干细胞向肿瘤微血管损伤部位归巢,其潜在机制及后续效应尚不明确。因此,本课题将分两部分,分别从HFRT对肿瘤细胞死亡方式及肿瘤微血管重塑两个方面进行系统研究。第一部分研究目的:NSCLC程序性坏死影响HFRT疗效及潜在机制研究。研究方法:成功建立干扰或过表达受体相互作用蛋白3(receptor-interacting protein kinases 3,RIP3)的稳定NSCLC细胞株,给予HFRT辐射后,通过克隆形成实验和流式细胞术分别检测NSCLC细胞的增殖能力及存活率;免疫荧光实验及免疫印迹检测调控程序性坏死的关键调节蛋白RIP3和混合系列蛋白激酶样结构域(mixed lineagekinase domain-like,MLKL)的表达及活化水平。免疫组化检测HFRT辐射荷瘤小鼠后,移植瘤组织中RIP3和MLKL的表达水平并绘制移植瘤生长曲线。同时,临床验证RIP3是否可作为早期中央型NSCLC患者接受立体定向放疗(stereotactic body radiotherapy,SBRT)疗效评价的有效标志物。研究结果:通过体内外实验研究发现,HFRT ≥10Gy/f辐射主要诱导NSCLC细胞发生程序性坏死,同时伴随RIP3及MLKL的表达水平上调及活化。本课题构建干扰RIP3表达及RIP3过表达的NSCLC细胞稳定株,HFRT辐射RIP3敲低及过表达NSCLC细胞株及移植瘤发现:干扰RIP3表达的NSCLC细胞的坏死率显著降低、克隆形成率显著增高、相应移植瘤相比对照组体积显著增加;而过表达RIP3的NSCLC细胞坏死率显著增加、克隆形成率显著降低。临床结果显示,肿瘤组织高表达RIP3的早期NSCLC患者接受SBRT后,其局部控制率及无疾病进展生存期显著优于低表达RIP3组(p<0.05),两组总生存无明显差异。研究结论:HFRT ≥10Gy/f辐射高表达RIP3的NSCLC细胞主要诱导其程序性坏死,RIP3可作为预测早期中央型NSCLC患者接受SBRT疗效评价的重要参考指标。第二部分研究目的:间充质干细胞参与SBRT中肿瘤微血管损伤修复的作用及机制研究。研究方法:体外实验ELISA检测SBRT诱导肿瘤细胞产生趋化因子如基质细胞衍生因子(stromal cell-derived factor-1α,SDF-1α)及血小板衍生生长因子-B(platelet-derived growth factor subunit B,PDGF-B)的表达水平,采用 Transwell小室模型检测间充质干细胞(Mesenchymastemcell,MSC)的迁移;通过体内实验,从表达绿色荧光蛋白(GFP)的转基因雄性小鼠C57BL/6J-Tg l0sb/J体内,鉴定并收集骨髓来源的MSC,并将其移植到接受亚致死性剂量照射的雌性小鼠C57BL/6J体内建立骨髓移植模型;给予Lewis肺癌(LLC)及恶性黑色素瘤(B16F10)小鼠移植瘤14Gy单次照射或联合给予SDF-lα/趋化因子受体4(C-X-C chemokine receptor type 4,CXCR4)的抑制剂 AMD3100 或PDGF-B/PDGFR-β的抑制剂伊马替尼(Imatinib)处理后,采用ELISA检测小鼠血清中趋化因子的表达水平,免疫荧光检测移植瘤中骨髓来源的MSC迁移归巢水平,微血管密度,周细胞包裹内皮细胞的丰度,并绘制小鼠移植瘤的生长曲线。研究结果:SBRT可显著促进肿瘤细胞释放SDF-lα及PDGF-B;且这些配体分别与骨髓来源的间充质干细胞上的受体CXCR4、血小板衍生生长因子受体β(Beta-type platelet-derived growth factor receptor,PDGFR-β)结合,从而趋化间充质干细胞归巢至肿瘤间质微环境;趋化至肿瘤微环境的间充质干细胞分化成周细胞,通过促进肿瘤微环境血管发生从而促进肿瘤的再生长;而相应的抑制剂 AMD3100 和 Imatinib 分别通过抑制 SDF-lα/CXCR4 和 PDGF-B/PDGFR-β 信号通路显著抑制间充质干细胞的归巢、肿瘤血管发生以及肿瘤的生长。研究结论:SBRT可通过SDF-lα/CXCR4和PDGF-B/PDGFR-β信号通路调控骨髓来源的MSC迁移至肿瘤间质微环境并分化为周细胞,从而诱导肿瘤血管发生,促进肿瘤复发生长。而靶向抑制此过程可能成为提高肿瘤放疗疗效的一种有效策略。