目的:恶性肿瘤的转移是晚期肿瘤患者死亡的主因,也是目前未能完全解决的问题。近十余年来,随着新一代测序技术的进步,癌症基因组层面上的转移机制已经被较为深入地研究。然而随着研究的深入,人们发现仍有相当一部分癌症的转移无法通过现有基因层面的机制解释,这促使人们试图从表观遗传学等新的角度阐明癌症转移的机制。近几年,以非编码RNA、染色质重组、DNA甲基化等研究方向为代表的表观遗传学为癌症转移机制的研究提供了新的思路。其中一些最新的研究表明,在转录后调控的水平上,RNA甲基化及其功能在癌症发生和发展过程中的作用十分重要。但是,目前RNA甲基化在癌症中作用的研究并不全面,尤其在转移方面的研究,仍然有待进一步的探索。m6A甲基化修饰(N6-methyladenosine)是RNA甲基化修饰中分布最广的一种,它是一种可逆的RNA修饰,同时受到m6A甲基转移酶和m6A去甲基化酶的调节。m6A甲基转移酶介导m6A甲基化修饰的形成,m6A去甲基化酶可以选择性地将m6A修饰去除,通过结合蛋白实现作用。目前已有的研究显示m6A涉及多个生物学过程,因此m6A修饰和m6A调节剂在各种疾病,尤其是恶性肿瘤中可能发挥的作用引起了极大的关注。最新研究证明,m6A调节剂的异常表达可通过改变RNA的m6A修饰水平来影响癌症的发展。但m6A调节剂的异常水平在各类癌症中起到的作用复杂而多变,它们可能通过调节不同的特异性靶基因而在不同类型的癌症中起到促进和抑制作用。然而这种作用在大多数肿瘤中没有被系统地分析,尤其是较为容易转移的两种癌症,三阴型乳腺癌和胃癌中。乳腺癌是女性常见恶性肿瘤,其发病率位于女性恶性肿瘤中的首位,且近年来发病率呈上升趋势。乳腺癌的早期诊断降低乳腺癌的死亡率,但在乳腺癌相关死亡中,大部分患者并不是死于乳腺癌原发灶,而是死于远处转移。在乳腺癌luminal分子分型的四种分型中,三阴型乳腺癌的预后较差的一种,且容易出现早期远处转移。因此,深入地探讨三阴型乳腺癌的转移机制对于提高三阴型乳腺癌患者的远期生存和生活质量具有极大的意义。胃癌是我国恶性肿瘤中发病率较高的一种,其发病病例数位于恶性肿瘤中的第二位,死亡病例居所有癌症死亡顺位第三位。在胃癌相关死亡中,远处转移是大部分患者死亡的主要原因之一。而我国早期胃癌发现率较低,很大一部分患者在确诊时就已经处于进展期,因此胃癌的转移极大地威胁到人们的生命健康。因此,深入地探讨胃癌的转移机制对于提高胃癌患者的远期生存和生活质量具有极大的意义。本研究探讨了目前五种主要的m6A调节剂在总体乳腺癌和三阴型乳腺癌中的作用有何不同,并初步探索了作用机制。在胃癌中纳入目前发现的所有m6A调节剂,并建立了预测预后的模型,并比较了胃癌和三阴型乳腺癌中同样调节剂的不同作用。这为未来的治疗和预后预测提供了依据。材料方法:1.使用KM-plotter在线数据库分别分析乳腺癌患者无远处转移生存期与 m6A 调节剂(METTL3,METTL14,WTAP,FTO 和 ALKBH5),COL3A1 的表达之间的关联。在GEPIA网站获得了 TCGA数据库和GTEx数据库在乳腺癌组织和正常乳腺组织中上述五个m6A调节剂的转录水平。使用TCGA数据库分析m6A调节剂与靶基因之间的相关性。选择来自GEO数据库的GSE62254数据集分析m6A调节剂和胃癌的病理参数及预后的相关性,使用GSE15459验证生存曲线。2.使用qRT-PCR 方法检测 METTL3、COL3A1 的 mRNA 表达水平。3.使用 Western blot方法检测METTL3、ALKBH5、COL3A1的蛋白表达水平。4.使用ELISA实验分别检测Ⅲ胶原蛋白α1链在细胞内外的表达水平。5.采用Transwell实验和细胞黏附实验检测细胞的转移能力。6.使用RNA甲基化免疫共沉降实验对COL3A1的m6A修饰水平进行检测。7.使用免疫组化实验对组织芯片中的METTL3和COL3A1水平进行检测。8.统计学处理:使用SPSS(版本16.0)和R(V.3.2.5)进行统计分析。使用了 Limma程序包以分析差异基因。使用了单因素COX回归和lassso回归分析了GSE62254数据集中26种m6A调节剂和胃癌OS的关系,使用卡方检验用于探索riskscore和胃癌临床病理学参数的关系,对riskscore和临床病理学参数与胃癌OS的关系进行多因素COX回归分析,并在GSE62254数据集和检验集GSE15459中绘制riskscore的Kaplan-Meier生存曲线。构建riskscore的列线图预后分析模型,并进行校正检验。One-way ANOVA和Student’s t检验用于确定统计学显著性,统计显著性被确定为小于0.05的P值。所有实验数据采用3次独立实验结果,以均值±标准差表示。结果:1.METTL3特异性地抑制三阴型乳腺癌转移。使用在线数据库分析了五种主要的m6A调节剂在三阴型乳腺癌中的预后作用,发现METTL3的低表达与三阴型乳腺癌的不良预后有关,且在乳腺癌组织中低表达,在三阴型乳腺癌中表达低于非三阴型乳腺癌组织。细胞实验证明METTL3敲减后三阴型乳腺癌细胞迁移、侵袭和黏附能力增强。2.METTL3通过上调COL3A1的m6A修饰水平使COL3A1表达水平降低。METTL3的沉默可以使COL3A1的m6A水平降低,从而上调Ⅲ型胶原蛋白 α1 链(collagen type III alpha 1 chain,COL3A1)的表达。同时 m6A 抑制剂环亮氨酸可以挽救METTL3过表达导致的COL3A1表达下降和转移能力减弱。免疫组化结果验证了这种相关性。3.COL3A1促进三阴型乳腺癌细胞转移能力。敲减COL3A1后,三阴型乳腺癌细胞的迁移、侵袭和黏附能力降低。4.有12种m6A调节剂在乳腺癌对胃癌的预后有意义,并构建了 riskscore。将已发现的26种m6A相关的调节剂纳入研究,利用GEO数据库中的数据集对它们和胃癌预后的关系进行分析,COX回归和lasso回归分析结果提示12种调节剂在两种分析中都有意义,并构建风险评分(riskscore)。5.riskscore高评分和胃癌不良预后相关。分析riskscore和胃癌临床病理参数及预后的关系,提示riskscore高评分和具有更高的TNM分期,更易出现腹膜转移。6.构建列线图预后预测模型可预测3年生存期概率。根据riskscore的回归分析结果构建列线图胃癌预后预测模型,并进行校正,表明对胃癌患者的3年生存概率的预测较准确。7.ALKBH5促进胃癌转移细胞转移能力。Lasso回归分析中,ALKBH5的系数最高,敲减ALKBH5使胃癌细胞中转移能力减弱。8.利用数据分析预测了 m6A调节剂在胃癌中可能的靶基因。将患者按riskscore风险评分分为两组,分析两组差异基因,并按照P<0.05,log FC>1筛选差异基因。对差异基因进行富集分析,挑选P<0.05,FDR<0.25的富集项目,发现其中很多和细胞外基质和细胞黏附相关的项目,这些基因可能是m6A调节剂参与调节转移的靶基因。结论:1.甲基转移酶METTL3通过增加COL3A1的m6A水平下调COL3A1的表达,从而特异性地抑制三阴型乳腺癌的转移。2.m6A调节剂的riskscore与胃癌预后不良相关。通过数据分析构建了 riskscore的预后预测模型,较准确地预测胃癌的3年生存率。3.去甲基化酶ALKBH5可促进胃癌的转移。4.预测了 m6A调节剂潜在的靶基因,为胃癌的治疗提供了潜在的治疗靶点。