“古典猪瘟”(Classical swine fever,CSF),也被称为猪瘟(Swine fever),是一种猪之间的高度接触性传染病,对养猪业是一个非常大的威胁。近几年来,该病不仅发病率明显增高,而且流行趋势和流行特点也越发复杂,其持续感染的情况在全世界普遍存在,这使得防控猪瘟的爆发遇到了新的瓶颈期。现有疫苗的预防效果有明显减弱的趋势,如传统的灭活猪瘟疫苗及弱毒(减毒)猪瘟疫苗存在免疫保护期短,毒力返强等缺点,而蛋白源性亚单位疫苗可以很好的解决这些问题。本研究选取具有强免疫原性的猪瘟病毒囊膜蛋白E2作为新型猪瘟疫苗的研究选材。随着交叉学科的发展,生物学与纳米材料技术的交叉渗透正日益增强,其中铁蛋白(Ferritin)自组装纳米颗粒技术引起了人们的关注。铁蛋白可自发组装形成均一、稳定的具有良好生物相容性的蛋白纳米颗粒,也因其独特的24亚基的空间结构,可成为理想的抗原呈递的多聚体纳米颗粒载体。大肠杆菌细胞E.coli(Escherichia coli,E.coli)的p ET表达系统是最常用来表达外源蛋白的,其具有清晰的遗传背景、生产成本低廉、繁殖速度快、表达产物易纯化、可高效表达外源蛋白及应用范围广等特点,但是因为是原核表达系统,所以会缺乏复杂的磷酸化、糖基化以及形成复杂二硫键等的翻译后修饰过程,对某些外源蛋白的正确折叠以及生物活性存在一定影响。本研究对猪瘟囊膜蛋白E2和铁蛋白的基因序列进行优化设计,并通过化学合成得到目的基因序列,利用融合PCR得到E2-Fe,将该基因克隆到p ET28a原核表达载体中,转化到E.coli BL21(DE3)中进行诱导条件的探索及其高效表达,将表达的融合蛋白进行Western-blotting验证、镍柱纯化、质谱及电镜检测。结果显示,融合基因E2-Fe已成功克隆到p ET-28a载体上,0.15%乳糖诱导6 h为融合蛋白表达的最优条件,Western-blotting与质谱图均显示融合蛋白的大小约51 KD与理论值相符,融合蛋白已成功在E.coli中大量表达,电镜观察到的纳米颗粒直径约为20 nm也与理论值相符,即融合铁蛋白的猪瘟病毒囊膜蛋白E2-Fe在大肠杆菌中得到高效表达。将大肠杆菌中表达的融合蛋白E2-Fe经纯化后制样腹腔注射小鼠,两次免疫后,其可诱导机体产生特异性抗体,效价可达1:6400,表明E2-Fe融合蛋白具有良好的免疫原性。杆状病毒-昆虫表达系统是重组蛋白生产的普遍选择。昆虫细胞中的蛋白表达包含翻译后修饰过程,此系统生产的蛋白质复合物以及高蛋白质产量是该真核表达系统的有利特征。后期随着研究的深入与生物技术的不断发展,杆状病毒开始在表面展示系统、基因治疗、疫苗研发等方面应用。在昆虫细胞和哺乳动物细胞中表达外源蛋白时,其糖基化修饰位点是一致的,但两者在修饰时所选用的寡糖种类却不尽相同。相对于哺乳动物细胞,昆虫细胞中相关的糖链加工酶表达量不足或者缺乏,在糖基修饰加工结束后无法合成复合型唾液酸结构,而是终止于寡甘露糖结构。这种寡糖修饰差异导致在昆虫细胞中表达的亚单位疫苗在理论上是不利于生产的,但是不完全加工的N-糖链修饰反而会增强禽流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)病毒样粒子与免疫细胞的亲和力。因此本研究也选择杆状病毒-昆虫表达系统来融合表达目的蛋白以期研制新型猪瘟疫苗。本研究对猪瘟囊膜蛋白E2和铁蛋白的基因序列进行优化设计,并通过化学合成得到目的基因序列,利用融合PCR得到E2-Fe,将融合基因克隆到杆状病毒转移载体p VL1393的多克隆位点中,获得重组载体p VL1393-E2-Fe,将重组转移载体p VL1393-E2-Fe与失活拯救型家蚕杆状病毒(re Bm Bac)共转染家蚕Bm5细胞,获得重组病毒,收集病毒液并感染五龄起家蚕,待家蚕有明显杆状病毒发病迹象后收集蚕血淋巴,随后进行Western-blotting、电镜观察验证。结果显示,重组转移载体p VL1393-E2-Fe测序结果正确,融合基因E2-Fe已成功克隆到p VL1393,且与re Bm Bac共转染家蚕Bm5细胞后获得有感染活性的重组杆状病毒re Bm Bac-E2-Fe;蚕血的Western-blotting图显示融合蛋白的大小约46 KD与理论值相符,融合蛋白已成功在家蚕中表达,而后通过电镜观察到大量直径约为20 nm且分布较为均匀纳米颗粒,也与理论相符,即融合铁蛋白的猪瘟病毒囊膜蛋白E2-Fe在家蚕中得到了高效表达。将含有E2-Fe融合蛋白的蚕血淋巴制样后腹腔注射小鼠,经两次免疫后,可诱导机体产生高滴度的特异性抗体,其效价可高至1:25600,即本研究所得E2-Fe融合蛋白具有较好的免疫原性。以上研究结果均说明融合蛋白在大肠杆菌及家蚕中都可进行高效表达,获得数量可观的纳米颗粒抗原,这为研究新的猪瘟疫苗拓宽了思路。