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大黄鱼(Larimichthys crocea)作为我国主要海洋养殖鱼类,随着养殖规模扩大、养殖产量增多,病害问题也日益突出,严重制约了大黄鱼产业的发展。解决病害问题的关键是提高鱼体自身免疫力,加强大黄鱼免疫机制的理论研究,有利于提升大黄鱼疾病控制与预防水平,促进水产养殖业持续健康发展。本文分析了大黄鱼小G蛋白家族中Rab5A、Rab11和Rab13三个基因的分子结构以及特征;运用荧光定量PCR技术检测了刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)、灭活的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和脂多糖LPS、射病毒类似物poly I:C进行免疫刺激后,不同组织mRNA水平表达变化;在大肠杆菌中进行了Rab5A基因重组表达,利用纯化的重组蛋白制备了多克隆抗体,并用Elisa方法确定最佳工作浓度及标定抗体效价,用于Western blot检测Rab5A蛋白组织表达量以及在免疫刺激后蛋白质水平表达变化。本研究还采用GST pull-down技术初步分析大黄鱼Rab5A互作蛋白,运用免疫电镜方法观察了大黄鱼不同组织/器官中Rab5A和Rab13的亚细胞定位。结果如下:(1)大黄鱼Rab5A基因的cDNA全长1 092 bp,包含651 bp的ORF,编码216个氨基酸,蛋白分子量为23.56 KDa,其中包含一个典型的RAB功能结构域。刺激隐核虫免疫刺激后,Rab5A在肝、脾和肾中显著上调(P<0.05),刺激后24 h时表达量达到峰值。腹腔注射poly I:C和LPS后,Rab5A基因显著上调表达。不同组织中Rab5A蛋白质表达量也存在差异,免疫刺激后Rab5A蛋白也明显上调表达。GST pull-down实验表明,Rab5A与淋巴细胞特异蛋白酪氨酸激酶(Lymphocyte-specific protein tyrosine kinase)、肌球蛋白轻链(myosin light chain)以及瘦素蛋白(Leptin)之间存在相互作用。(2)大黄鱼Rab11基因的cDNA全长1 373 bp,其中开放阅读框为657 bp,编码218个氨基酸,蛋白分子量为24.45 KDa,等电点约为5.64,有6个丝氨酸磷酸化位点、1个苏氨酸磷酸化位点和2个酪氨酸磷酸化位点。刺激隐核虫免疫刺激后,在肝、脾和肾中Rab11表达量均显著上调(P<0.05),且在24 h-72 h中的不同时段达到峰值。腹腔注射副溶血弧菌和脂多糖LPS后,Rab11基因也显著上调表达。(3)大黄鱼Rab13基因的cDNA全长2 390 bp,开放阅读框为603 bp,编码200个氨基酸,蛋白分子量为22.4 KDa,等电点9.43。刺激隐核虫免疫刺激后,肝、脾和肾中Rab11表达量显著上调(P<0.05),均在刺激后48 h达到峰值。腹腔注射副溶血弧菌和LPS以及poly I:C,检测组织中Rab13基因表达量也显著上调。通过免疫电镜观察结果显示,脾脏中Rab13定位于细胞膜表面的纤维中,提示Rab13在细胞间的物质转运调节中扮演着重要角色。上述研究结果表明,大黄鱼Rab5A、Rab11和Rab13在寄生虫病、细菌疾病和病毒感染的免疫应答过程中可能发挥重要的作用。