研究背景抑郁症（Major depressive disorder,MDD）是一种以持续性情绪低落、兴趣缺失为主要临床特征的常见精神疾病。其终生患病率在11%-15%之间。在中国,已有超过9500万人受到抑郁症困扰。抑郁症已成为仅次于癌症影响人类健康的第二大疾病。研究表明肠道微生物对中枢神经系统的各种功能有着重要影响,大脑与肠道菌群之间存在双向调节,以此为基础研究者提出了一种新颖的概念模型“微生物-肠-脑（Microbe-gut-brain,MGB）轴”。已有研究发现,情绪障碍（如情绪低落、焦虑）与胃肠道疾病（如肠易激综合征、炎症性肠病）之间有着高度的相关性,这表明肠-脑轴（Gut-Brain Axis,GBA）在情绪障碍的病理生理过程中发挥了重要的调节作用。肠道菌群调节大脑功能和行为表型的潜在机制仍然不清楚,故本研究采用同位素相对标记与绝对定量（Isobaric tags for relative and absolute quantitation,i TRAQ）蛋白质组学技术检测海马（情感神经环路中的关键脑区）中蛋白表达变化,以探究肠道菌群调节宿主脑功能的潜在机制。目的通过分析无菌（Germ-free,GF）小鼠、重定植细菌（Colonized GF,CGF）小鼠和无特定病原菌（Specific pathogen-free,SPF）小鼠海马组织中蛋白表达变化,解析肠道微生物调控海马功能的潜在机制。方法1.小鼠饲养及CGF小鼠模型构建:本研究使用5周龄BALB/c雄性小鼠。SPF组小鼠饲养在普通SPF级饲养房;GF组小鼠饲养在无菌隔离器中;另将部分GF小鼠放置在装有SPF小鼠粪便和垫料的饲养笼中进行肠道菌群定植3周,以获得CGF小鼠。2.采用i TRAQ技术联合液相色谱-串联质谱分析（Liquid Chromatography-Mass Spectrometry,LC-MS/MS）技术对GF、CGF和SPF小鼠的海马组织进行蛋白质组学检测,根据p值<0.05和差异倍数值（Fold change,FC）>1.2或<0.83的标准筛选出差异表达蛋白,分析肠道微生物引起的大脑分子改变。3.比较GF vs.SPF及GF vs.CGF两个比较组的差异蛋白,筛选肠道菌群重定植以后表达量逆转的蛋白,探索受肠道微生物特异调节的蛋白改变;4.采用基因本体论（Gene Ontology,GO）富集分析对不同比较组之间的差异蛋白进行功能注释,使用独创性通路分析（Ingenuity Pathway Analysis,IPA）软件对差异蛋白进行功能通路富集,通过蛋白-蛋白互作（Protein–protein interactions,PPI）分析获得蛋白质相互作用的功能调节网络,探究肠道微生物调节海马功能的潜在机制;5.将本研究蛋白组学结果与课题组前期无菌小鼠中m RNA芯片结果进行整合分析,进一步探究肠道微生物参与调节脑功能的潜在机制。结果1.本研究共鉴定到5514个蛋白质,根据上述筛选标准,GF vs.SPF、CGF vs.SPF和GF vs.CGF比较组中发现大量差异表达蛋白。2.在GF vs.SPF比较组中共发现303个差异蛋白,其中61个蛋白上调,242个蛋白下调。对上调和下调蛋白分别进行生物信息学分析,结果发现上调蛋白主要与糖皮质激素受体通路紊乱有关,下调蛋白主要与Janus激酶2（Janus kinase 2,JAK2）在激素样细胞因子中的作用信号通路和肿瘤坏死因子受体1（Tumor necrosis factor receptor 1,TNFR1）信号通路紊乱有关;3.在GF vs.CGF比较组中共发现335个差异蛋白,其中74个蛋白上调,261个蛋白下调。对这335个差异蛋白质进行生物信息学分析,结果表明AMPK信号通路是改变最显著的功能通路;4.通过比较GF vs.SPF及GF vs.CGF比较组差异蛋白,共发现124个蛋白质的表达水平在肠道菌群定植后被显著逆转,对这124个受肠道微生物特异调节的蛋白进行生物信息学分析,结果发现糖皮质激素受体信号通路和炎症相关通路是改变最为显著的功能通路。结论肠道微生物紊乱会引起脑内大量蛋白质表达发生改变,这些差异表达蛋白主要与糖皮质激素受体信号通路和炎症相关通路有关。目前的结果表明,这些紊乱的功能通路可能参与了肠道微生物群调节大脑海马功能和行为表型的病理机制。本研究为解析肠道微生物紊乱相关疾病的病理机制提供了新见解。研究背景抑郁症（Major depressive disorder,MDD）主要表现为心境低落、思维迟缓、意志活动减弱和认知功能损害等。越来越多的证据表明,mi RNA-m RNA调控网络在抑郁症发病中具有重要作用。然而,其具体的潜在生物学机制非常复杂,至今仍不清楚。因此,进一步探索mi RNA-m RNA互作参与抑郁症发病的机制意义重大。故本研究基于基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus,GEO）及前期发表数据分析了抑郁症患者血液中mi RNAs和m RNAs的变化,并构建mi RNA-m RNA调控网络,进一步通过生物信息学分析方法寻找关键致病通路,并在慢性社会挫败应激（Chronic social defeat stress,CSDS）抑郁小鼠中进行验证。目的通过分析抑郁症患者血液中mi RNAs和m RNAs表达改变,解析mi RNA-m RNA调控网络参与抑郁症发病的生物学机制。方法1.通过检索GEO公共数据库,筛选抑郁症患者血液mi RNAs表达谱数据,采用GEO2R分析MDD患者中差异表达的mi RNAs（Differentially expressed mi RNAs,DEMs）。2.采用Target Scan,DIANA-Tar Base v8,mi RDB,mi RTar Base和mi RWalk软件预测DEMs的靶基因。3.基于荷兰抑郁症和焦虑症研究（Netherlands Study of Depression and Anxiety,NESDA）、葛兰素史克-高通量疾病特异性靶点识别计划（Glaxo Smith Kline–High-Throughput Disease-specific target Identification Program,GSK-Hi TDi P）研究和Janssen–脑资源公司（Janssen–Brain Resource Company,Janssen–BRC）研究筛选MDD患者血液差异表达的m RNAs（Differentially expressed m RNAs,DEGs）。4.将DEMs的靶基因与DEGs进行重叠分析,筛选交叉的基因,并构建mi RNA-m RNA调控网络,并进一步对交叉的基因进行生物信息学分析。5.构建CSDS抑郁小鼠模型。采用时定量聚合酶链反应技术（Quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR）在CSDS抑郁小鼠前额叶皮层中进行关键mi RNAs和致病通路验证。结果1.根据筛选标准,我们在GEO数据库中共筛选出两个mi RNAs表达数据集,分别是GSE81152和GSE152267,在这两个数据集中鉴定到了3个重叠的DEMs,共预测到9143个靶基因。2.基于NESDA研究,总共鉴定到129个DEGs;基于GSK-Hi TDi P研究和Janssen–BRC研究,总共鉴定到165个DEGs。将DEGs和DEMs靶基因进行重叠分析,鉴定到119个交叉的DEGs。进一步构建了包括上述3个DEMs和119个交叉DEGs的mi RNA-mRNA调控网络。3.通过对这119个交叉DEGs进行功能分析发现,以Th17细胞分化障碍为特征的炎症反应异常是抑郁症中改变最显著的生物学过程。4.经CSDS抑郁造模后,小鼠表现出明显的抑郁及焦虑样行为。在CSDS小鼠模型前额叶中对关键mi RNAs和Th17细胞分化通路相关基因进行q RT-PCR验证,结果发现在CSDS抑郁小鼠中mi R-194-5p、白细胞介素（Interleukin,IL）-17、IL-21、IL-22和IL-1β表达下调,而维甲酸受体相关孤核受体γt（Retinoic acid receptor-related orphan receptor gammat,RORγt）表达上调。结论本研究提示mi RNA-m RNA调控网络通过引起以Th17细胞分化障碍为特征的炎症反应异常诱导抑郁症的发生和发展。此研究为探索MDD的发病机制、筛选潜在的生物标志物和治疗靶点提供了重要的线索。