研究背景中国是食管鳞癌高发国家,目前外科手术是胸中段食管鳞癌的主要治疗手段,但手术效果并不理想,5年生存率约为30%～50%,一半以上的患者在手术后2-3年内出现肿瘤复发,主要的复发模式为局部区域复发,其中颈部、锁骨上及纵隔淋巴结转移占较大比例。尽管目前在食管鳞癌早期诊断及综合治疗方面取得了一定的进步,食管癌的转移及复发仍是临床治疗所面对的最大难题,直接影响着患者的生存预后。所以研究食管鳞癌转移的分子生物学机制,对指导食管癌患者选择治疗方案和判定预后具有重要的临床价值。肿瘤的转移是恶性肿瘤最重要的生物学特性之一,是一个多步骤、多因素参与的极其复杂的过程,但其具体机制尚未明确。研究证实,肿瘤的转移不是随意的,而是具有选择性的,即器官转移特异性。1889年Peget提出的“种子—土壤’学说(the "seed and soil" hypothesis)认为,肿瘤的转移是特定的肿瘤细胞(种子)在适宜其生长的器官环境(土壤)中生长发展的结果。1928年Ewing的“解剖或机械”理论(the anatomical or mechanical theory)以器官的血液、淋巴引流方向解释转移的发生。而后来在肿瘤特异性转移的研究中出现了新的概念：“归巢”理论(the homing theory);该理论认为,肿瘤细胞转移到特定器官是由于不同器官通过趋化作用捕获或吸引特定类型肿瘤细胞而使肿瘤细胞“归巢”的结果。近年来,化学趋化因子受体—配体信号轴的研究发现为“归巢”理论提供了有利的证据。趋化因子是细胞因子超家族中一类具有化学趋化作用的分泌型小分子蛋白,由70～125个氨基酸组成,分子量8～15kD不等。迄今为止至少已发现50余种趋化因子及20余种受体。根据其N末端4个保守半胱氨酸(Cys)残基的前两个半胱氨酸残基的位置,可将趋化因子分为4个亚家族—CXC、CC、C、 CXC亚家族。趋化因子受体是一类介导趋化因子行使功能的GTP蛋白耦联的跨膜受体,通常表达于免疫细胞、内皮细胞等细胞膜上；7个跨膜区将分子分成细胞外自由的N端、3个细胞外环和C端几个部分。趋化因子与细胞表面的特异性受体结合后可参与多种生理和病理过程,如细胞生长、发育、分化、凋亡、组织损伤、肿瘤的生长和转移等。2001年Muller A首次提出了肿瘤细胞可以利用趋化因子及其受体的特异性结合实现器官特异性转移,研究发现乳腺癌细胞高表达趋化因子受体CXCR4和CCR7,而CXCR4的配体CXCL12多表达于乳腺癌的特异转移部位肺、肝脏、骨髓等,而CCR7的配体CCL21则多表达于淋巴结组织,从而导致了乳腺癌细胞的定向转移。越来越多的研究表明,趋化因子CXCL12/CXCR4信号轴在肿瘤的器官特异性转移中与趋化因子受体CCR7及其配体在肿瘤淋巴结转移中均发挥着愈加重要的作用。目前,国内外对趋化因子与食管鳞癌生物学的研究仍较为少见。本课题应用免疫组化检测、Western blot及RT-PCR三种方法联合检测趋化因子受体CXCR4与食管鳞癌生物学行为及预后的相关性研究；应用RT-PCR、免疫组化及Western blot三种方法联合检测趋化因子受体CCR7与VEGF-C在食管鳞癌患者癌组织及转移淋巴结中的表达情况,意在探索食管癌淋巴结转移的可能机制。目的食管鳞癌淋巴结转移的发生与食管癌细胞的趋化迁移及肿瘤淋巴管生成关系密切。本文旨在于探讨趋化因子受体CXCR4表达与胸中段食管鳞癌生物学行为及预后的相关性,以及趋化因子受体CCR7及VEGF-C的表达对食管癌淋巴结转移潜能的影响。方法临床收集2003年6月-2006年6月间山东大学附属省立医院完全切除、临床资料完整的184例胸中段食管鳞癌患者纳入回顾性研究。本组病例无手术前放／化疗者。采用经右胸和上腹部二切口食管癌切除、胃食管右胸顶吻合术(Ivor-Lewis手术)吻合者132例；采用经左胸食管癌切除、胃食管主动脉弓上水平(弓上吻合)吻合者52例。同时收集2009年4月至2009年12月间在山东大学附属省立医院胸外科施行食管癌完全切除加系统淋巴结清扫的60例胸中段食管鳞患者的标本,包括食管癌组织、淋巴结组织及随即选取的20例癌旁正常食管组织。应用免疫组化方法检测184例胸中段食管鳞癌患者标本中CXCR4蛋白的表达情况,随访患者,应用Kaplan-Meier法计算生存率,绘制生存曲线,Log-rank检验比较生存差别,Cox多因素回归分析判定食管癌患者预后的独立危险因素。对60例胸中段食管鳞患者的标本应用RT-PCR和Western blot方法检测标本中CXCR4表达,应用χ2检验比较CXCR4表达情况的差异,判定CXCR4表达与食管鳞癌浸润转移的关系。应用RT-PCR方法检测60例胸中段食管鳞癌患者标本中CCR7mRNA及VEGF-C mRNA的表达；应用免疫组化与Western blot方法检测CCR7及VEGF-C蛋白的表达情况,D2-40标记淋巴管内皮细胞以计数淋巴管密度(LVD)。应用χ2检验比较CCR7及VEGF-C表达情况的差异,u检验比较LVD的差异情况,应用Spearman等级相关对CCR7和VEGF-C的表达进行相关性分析,应用Logistic多因素回归分析判定影响食管癌淋巴结转移潜能的独立相关危险因素。结果1.184例患者肿瘤组织中Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期患者CXCR4表达率分别为30.0%,69.6%和82.3%,差异有统计学意义(χ2=12.219,P=0.002)；T1、T2和T3患者CXCR4表达率分别为33.3%、64.7%和78.5%,CXCR4表达率差异有统计学意义(χ2=12.713,P=0.002)。有、无淋巴结转移患者CXCR4表达率分别为82.7%和63.1%,两组CXCR4表达率差异有统计学意义(χ2=8.600,P=0.003)。有、无CXCR4表达患者的5年生存率为26.5%和65.4%,两组差异有统计学意义(P=0.000)。T2患者中,有、无CXCR4表达在者5年生存率分别为36.4%和66.7%,两组差异没有统计学意义(P=0.075)；T3患者中,有、无CXCR4表达组的5年生存率分别为22.1%和57.7%,两组差异有统计学意义(P=0.006)。pN0患者中,有、无CXCR4表达患者5年生存率分别为38.5%和71.1%,两组差异有统计学意义(P=0.005)；pNl患者中,有、无CXCR4表达组5年生存率分别为14.9%和50.0%,两组差异有统计学意义(P=0.048)。Cox回归分析结果显示,肿瘤浸润、淋巴结转移和CXCR4蛋白表达是食管癌患者术后独立的预后危险因素。在60例患者的食管癌组织中,RT-PCR方法检测有44例(73.3%)CXCR4mRNA,其表达与食管鳞癌的肿瘤浸润及淋巴结转移明显相关；Western blot方法方法检测有42例(70.0%)CXCR4蛋白表达阳性,其表达也与食管鳞癌的肿瘤浸润及淋巴结转移明显相关。2.在60例患者的食管鳞癌组织中,RT-PCR方法检测有46例(76.7%)CCR7mRNA及33例(55.0%)VEGF-C mRNA表达阳性,免疫组化方法检测有43例(71.7%)CCR7蛋白及29例(48.3%)VEGF-C蛋白表达阳性,Western blot万法检测有44例(73.3%)CCR7蛋白及31例(51.6%)VEGF-C蛋白表达阳性。CCR7及VEGF-C在食管癌组织中的表达均与淋巴结转移状态明显相关(P<0.05),而CCR7与VEGF-C的共同表达较单一表达与淋巴结转移状态有更为显著的相关性(P<0.05)。食管鳞癌组织中LVD较正常食管组织中明显增高(P<0.05),且与CCR7、VEGF-C的表达及食管癌淋巴结转移状态显著相关(P<0.05)。29例有转移的淋巴结中CCR7、VEGF-C mRNA的表达率为86.2%、69.0%,分别高于无转移的淋巴结(22.6%、19.3%),并与食管癌组织具有高度同源性。三种方法检测CCR7及VEGF-C在食管鳞癌中的表达明显高于正常食管组织(P=0.000)。Spearman等级相关分析表明,在食管鳞癌组织中CCR7表达与VEGF-C表达呈显著正相关。Logistic多因素回归分析结果显示：食管鳞癌组织中CCR7阳性表达(OR=12.044, P=0.012), VEGF-C阳性表达(OR=5.976,P=0.015)及肿瘤浸润(OR=0.110,P=0.012)是影响胸中段食管鳞癌患者淋巴结转移潜能的独立危险因素。结论CXCR4在食管鳞癌组织表达随肿瘤的浸润和淋巴结转移而明显增高,CXCR4表达的胸中段食管鳞癌患者预后不良,CXCR4表达是判定食管鳞癌患者预后不良的一种指标。CCR7及VEGF-C在食管鳞癌患者的食管癌组织及淋巴结转移灶中均表达明显增高,并与食管癌淋巴结转移状态密切相关；CCR7的表达与VEGF-C的表达成明显正相关；CCR7与VEGF-C的共同表达可能促进了食管鳞癌淋巴结转移,亦可作为预测食管鳞癌患者淋巴结转移潜能的调控基因。