水稻是重要的粮食作物之一,世界上约有1/2的人口以大米为食,水稻收成的好坏直接关系到世界粮食安全。褐飞虱是水稻的主要害虫,以取食水稻叶鞘韧皮部汁液为生,取食过程不仅伤害了水稻植株还传播病毒,造成了水稻大量死亡和减产。褐飞虱在为取食过程中分泌的唾液,对于成功取食有重要作用。褐飞虱取食时口针穿刺叶鞘组织进入维管束的过程会分泌胶状唾液,形成口针鞘保护口针,帮助口针成功刺入维管束。褐飞虱在吸食维管束汁液时,主要分泌水状唾液。褐飞虱唾液中含有许多蛋白质,包括酶和效应子,酶类可以水解细胞壁,效应子则在与植物互作过程中发挥功能。本实验室前期研究中鉴定了一个与抗虫蛋白BPH14互作的褐飞虱唾液蛋白PIB14,功能分析表明PIB14是与BPH14相对应的效应子。本论文对PIB14作了进一步研究,取得了如下研究结果:1、将PIB14基因转入不同水稻品种之中,用相对荧光定量PCR的方法分析了转基因材料中抗性相关基因的表达量,并用M22酶标仪测量不同实验组的活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）含量,以进一步验证PIB14为BPH14对应的效应子。结果显示PIB14在不含抗性基因的日本晴（Nipponbare,Nip）中可以引起免疫相关基因的下调表达和抑制ROS的爆发,而在含BPH14的抗性材料RI35中可以引起免疫相关基因的上调表达和ROS的爆发。实验结果说明PIB14在Nip中可以引起免疫感性反应;在RI35中能被BPH14识别,重新引起免疫反应,是PIB14对应的效应子。2、前期研究发现BPH14蛋白可以降解PIB14,且加入自噬抑制剂后能够减弱PIB14的降解,推测BPH14蛋白是通过自噬途径降解PIB14。利用荧光共聚焦显微镜和透射电子显微镜观察不同实验组细胞中的自噬小体数目,显示在本氏烟草中共表达BPH14和PIB14时,相比只表达BPH14或者PIB14,烟草细胞中的自噬小体数目明显增多,说明BPH14与PIB14相互作用诱发自噬。当BPH14的同源蛋白NIP14与PIB14在本氏烟草共同表达时,相比只表达NIP14或者PIB14,细胞中的自噬小体无明显积累,说明PIB14的识别具有特异性。在水稻中,相比RI35,RI35PIB4叶鞘维管束伴胞的自噬小体数明显增多,说明在水稻细胞中同时表达BPH14和PIB14,能诱发自噬增多。3、上述实验结果证明BPH14是通过自噬降解PIB14的,为进一步验证自噬途径对BPH14的抗虫产生的影响,对此本论文通过查找水稻自噬相关基因,设计靶位点,构建CRISPR/Cas9载体,进行RI35的CRISPR/Cas9载体转基因,实现对RI35中的水稻自噬相关基因敲除。然后对转基因材料提DNA检测敲除是否成功,将自噬相关基因敲除成功的转基因苗移栽到海南进行繁殖。目前基因敲除水稻已经收种,预计暑假可以开展抗虫鉴定实验,验证自噬相关基因敲除对BPH14抗性的影响。4、为了深入研究PIB14的功能,将PIB14进行了原核表达和纯化,为后续实验重新制备特异性PIB14抗体。我们将PIB14连入PET-28a-c（+）载体,转入BL21细胞,并探索出表达PIB14蛋白的最佳条件:1 m M IPTG,16℃进行过夜诱导。然后通过Ni-NTA柱纯化,进而通过透析复性得到了PIB14蛋白,送公司制备抗体,通过对抗体进行Western Blot检测,得到特异性较好的1号抗体。本论文的实验结果为水稻与褐飞虱的互作机理研究提供了新的证据,但BPH14与效应子PIB14之间的具体互作机制还需要后续研究。