胆固醇是人类基本生命活动中的一类重要的甾醇类分子,由一个环戊烷多氢菲的甾核以及烷基侧链组成。胆固醇参与细胞膜的形成,同时也是胆汁酸,甾醇类激素和一些维生素的合成前体。细胞内胆固醇水平的稳定依赖于胆固醇的外排,吸收以及内源合成。外源提供的LDL（low density lipoprotein）通过LDLR（low density lipoprotein receptor）内吞进入早期内体（early endosomes）,由溶酶体内胆固醇酯酶水解胆固醇酯成为游离胆固醇从早期内体分选递送到晚期内体/溶酶体（late endosomes/lysosomes）中,NPC1（NPC intracellular cholesterol transporter 1）和NPC2（NPC intracellular cholesterol transporter2）在溶酶体中起到重要的运输胆固醇的作用。但是胆固醇是通过什么机制被插入溶酶体膜上,又是如何从溶酶体运送到其他的细胞器以及质膜上,这些机制我们目前仍未研究清楚。本论文的研究中,我们利用一套完整的筛选系统想找到在细胞内胆固醇转运过程中起作用的新蛋白。我们利用CRISPR-Cas9文库结合Amphotericin B处理筛选参与细胞内胆固醇转运的关键蛋白,CRISPR-Cas9文库病毒感染之后细胞发生基因突变,胆固醇运输发生障碍的细胞具有Amphotericin B抗性。经过5轮筛选之后,我们通过lysotracker染色结合流式细胞分选技术富集具有明显胆固醇堆积表型的细胞,然后经过高通量测序和功能鉴定分析,我们确定了67个候选基因。将这些候选基因按照功能分类后,我们发现这些基因涉及细胞内囊泡运输,脂质代谢,细胞生长周期等领域。通过RNA interfere技术敲降候选基因的表达以及候选基因的敲除细胞,我们验证候选基因的Amphotericin B抗性以及Filipin染色表型,找到一些可能影响胆固醇运输的基因,并通过质谱技术找到这些基因的相互作用蛋白,后期用小鼠动物模型探索该基因在生理条件下的功能,通过确定这些基因的功能发现可能是细胞内胆固醇转运中的新蛋白。细胞内胆固醇运输障碍会引发严重的疾病,本研究的目的是希望能找到影响细胞内胆固醇运输的新的蛋白,研究细胞内胆固醇运输的详细机制,为细胞内胆固醇运输障碍所引发的疾病找到潜在的治疗手段。