枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)是一类产芽胞的革兰氏阳性菌,其不含内毒素,是国际上一种公认的安全微生物。枯草芽胞杆菌的用途广泛,常被用于植物生长的促进剂、植物病害的生物防治剂、食用益生菌、工业酶的生产菌株及异源蛋白的表达宿主等。将外源质粒导入枯草芽胞杆菌中来构建合适的基因工程表达系统使得枯草芽胞杆菌的应用前景更加广阔。因此,在枯草芽胞杆菌中发展高效的遗传操作体系就成为了研究的热点。目前,实验室已经在枯草芽胞杆菌中建立了相对完善的质粒遗传转化体系,包括原生质体转化、传统二步法转化和电转化等。虽然这些体系已经被广泛使用和优化,但是这些方法存在操作复杂、转化效率低和难以应用到野生枯草芽胞杆菌中等问题。因此,提高枯草芽胞杆菌中质粒的转化效率和简化实验操作是促进枯草芽胞杆菌在工业上应用的关键。已有相关报道认为相较于甲基化的DNA片段,非甲基化DNA及DNA的多联体形式能够提高DNA片段在枯草芽胞杆菌中的转化效率。本研究探究了DNA去甲基化和多联体形式对枯草芽胞杆菌质粒转化效率的影响和这些处理是否解决野生枯草菌株难以转化的问题。本研究采用Evomic Science公司优化的phi29 DNA聚合酶扩增试剂盒,通过phi29 DNA聚合酶扩增质粒得到连续的、非甲基化的长片段DNA并开展相关转化实验。通过二步法和电转转化,我们发现质粒的等温滚环扩增(Rolling-circle amplification,RCA)产物的的转化效率均是原始质粒的10~2倍左右,表明质粒经处理后的非甲基化及多联体形式的确能够大幅度提高质粒DNA的转化效率。但是,我们发现即使经去甲基化处理和形成多联体,质粒仍然不能通过二步法和电转法被转化到野生枯草芽胞杆菌中,表明这些操作不能解决野生菌株难以被转化的问题。我们发现表达氯霉素抗性的p GK12质粒及其RCA扩增产物在所测试的质粒中转化效率是最高的。在p GK12质粒的基础上插入长度不同的外源片段来构建一系列长度不同的质粒(4.5 kb-8.5 kb),发现增加质粒的长度不影响它们及其RCA扩增产物的转化效率。综上所述,我们发现去甲基化和多联体的形式确实有助于增强枯草芽胞杆菌转化的效率,但是这些操作对野生枯草芽胞杆菌的转化没有帮助。在本研究中,我们还基于实验室前期发现的枯草芽胞杆菌细胞间基因水平转移的工作基础开发了一种新型的、发生在固体培养基平板上的枯草芽胞杆菌细胞间的质粒水平转移方法。在我前期研究中,我们发现当两株不同的枯草芽胞杆菌在压力下共培养时,染色体DNA的水平转移可以发生。本研究中我们发现,在同样的处理下也可以发生质粒的转移。本研究以多重氨基酸营养缺陷型的菌株TLPHMCΔamy E作为质粒供体菌株,避免细胞间遗传物质双向转移对实验结果的干扰。在该转化方法中,我们把供体菌和受体菌分别在合适的培养基中培养后,将混合菌液放置于固体平板上的微孔滤膜上,共培养一段时间后,即可实现质粒的转移。我们发现转化子在供受体混合菌液培养3 h左右即开始产生,而且转化子的数目随着共培养时间的增加而增加。我们探究了不同因素对细胞间质粒转化效率的影响。我们发现当受体菌为枯草芽胞杆菌168菌株,选择压力为氯霉素抗性时,质粒转化的最佳抗性压力条件为C50(50μg/ml);当选择压力为红霉素抗性时,质粒转化的最佳抗性压力条件为E2(2μg/ml);当选择压力为卡那霉素抗性时,质粒转化的最佳抗性压力条件为K30(30μg/ml)。当质粒框架一致,而抗性基因不同时,采用卡那霉素筛选时,转化子的数目分别是采用氯霉素和红霉素为选择压力时的100倍和10倍。我们还发现细胞间质粒转化的效率随着目的质粒的长度增加而降低:当目的质粒的长度增加1倍时,其转化效率降低3倍左右。此外,我们发现供受体菌的比例对转化效率也有显著的影响,当供受体菌的菌体数量混合比例为1/1时,转化的效率最高。通过该方法,我们不仅在枯草芽胞杆菌模式菌株168中实现了质粒的高效定向转移,还成功的将目的质粒转进了两株野生枯草芽胞杆菌和两株解淀粉芽胞杆菌中。这些结果说明细胞间基因水平转移技术不仅操作简便、而且比目前已有的实验室转化方法具有更广的菌株适用性。枯草芽胞杆菌的应用前景广阔,但是实现野生芽胞杆菌的转化一直是芽胞杆菌研究领域的难点。本研究通过去甲基化和形成多联体DNA的方法大大地提高了实验室常用的二步法和电转法的质粒转化效率,还构建了在固体平板上进行的芽胞杆菌间质粒定向转移的转化体系,解决了质粒不能被转进野生枯草芽胞杆菌的难题。我们研发的细胞间质粒转化的方法不仅实验过程简便易行,而且高效,为建立新的芽胞杆菌表达系统提供了新的方法和途径。