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目的本研究课题旨在以大鼠肝星状细胞HSC-T6和肝纤维化模型大鼠为研究对象,利用云南丰富的佤族药材资源,通过调查筛选出可能具有防治肝纤维化作用的药材。调研筛选出的佤药材在体外作用于HSC-T6,通过Celigo Cytomter全视野细胞扫描分析仪分析评价药物对HSC-T6细胞增值、细胞活力的影响,希望能得到具有明显抑制HSC-T6细胞生长或促进其凋亡的有效药材。然后,再通过体内选取上述筛选实验效果最佳的一种药材对肝纤维化的大鼠模型进行实验研究。方法细胞实验:HSC-T6细胞系购自中国科学院昆明动物研究所细胞库,并用RPMI-1640培养基培养大鼠肝星状细胞,将HSC-T6在培养箱中于37℃和5%CO2饱和湿度下培养。采取对数生长期的HSC-T6,以1×104个/孔的标准将每组细胞接种在96孔板中,加入相应浓度的实验药材（经过0.2 um滤膜过滤）,分别使药材在96孔板中刺激作用24 h、48 h、72 h后将之取出,用Celigo Cytomter全视野细胞扫描分析仪检测细胞增值和细胞活力情况。动物实验:将85只SD大鼠,雄性,体重200±20g,随机分为6组,正常对照组10只,剩下的每组15只,有正常对照组、模型组、复方鳖甲软肝片阳性组以及高、中、低剂量的牛尾巴蒿组。除正常对照组外,其余各组均采用复合方法建立肝纤维化动物模型--40%CCL4油剂皮下注射,初始注射量为5.0ml/kg,此后以3.0ml/kg的标准每3天注射一次,皮下注射40%CCL4油剂,连续注射4周,同时每隔一天一次以高脂饲料和10%乙醇喂养,剂量为2ml/kg。根据每一周所称量的体重计算当周每日的灌胃剂量。复方鳖甲软肝片阳性组的灌胃标准为0.54g/kg·d（浓度0.027g/ml,磨成粉后用生理盐水配制）,牛尾巴蒿高（浓度0.5g/ml）、中（浓度0.25g/ml）、低（浓度0.125g/ml）剂量组分别灌胃20ml/kg牛尾巴蒿水提液,正常对照组与模型组以等体积水灌胃。观察并记录实验过程中的一般情况,经过4周的实验后,禁食12小时,称量最后一次的体重并记录,用电子秤称量肝脏重量并计算肝脏脏器系数,全自动分析法和酶联免疫吸附法分别检测大鼠的肝功能指标和肝纤四项指标;采用Masson染色法制备肝脏病理组织切片,观察肝纤维化程度。结果1.细胞实验研究表明在24h时:与模型组比较,在浓度（μg/mL）为200、400、1000时,编号23,P<0.01为差异有非常显著性意义,在浓度为800时P<0.05为差异有显著性意义;编号08在浓度为200时P<0.05为差异有显著性意义。在浓度为1000时,与模型组比较阳性组P<0.01为差异有非常显著性意义,在浓度为200、400时P<0.05为差异有显著性意义。与模型组比较,在浓度为200时,编号09、13、17,P<0.01为差异有非常显著性意义;阳性组及编号11当浓度为200时,P<0.05为差异有显著性意义。当浓度为400时,阳性组及编号09、13、17,P<0.05为差异有显著性意义。编号09、11、13、17、20,在浓度为800时,P<0.01为差异有非常显著性意义。在浓度为1000时,编号13、17、30,P<0.01为差异有非常显著性意义;阳性组在浓度为1000时,P<0.05为差异有显著性意义。在48h时:与模型组比较,在浓度为400、800、1000时,编号23,P<0.01为差异有非常显著性意义;编号22在浓度为1000时,P<0.05为差异有显著性意义;在浓度为400和1000时阳性组P<0.05为差异有显著性意义。与模型组比较,当浓度为200时,编号05,P<0.01为差异有非常显著性意义。编号13在浓度为400时,P<0.01为差异有非常显著性意义;在浓度为400时阳性组及编号05,P<0.05为差异有显著性意义。在浓度为800时,编号05、13,P<0.01为差异有非常显著性意义。当浓度为1000时编号13、30,P<0.01为差异有非常显著性意义;在浓度为1000时,阳性组,P<0.05为差异有显著性意义。在72h时:与模型组相比,在浓度为400、800、1000时,编号23,P<0.01为差异有非常显著性意义;编号22和编号08分别在浓度为1000、400时,P<0.05为差异有显著性意义;在浓度为800时编号08,P<0.01为差异有非常显著性意义。阳性药浓度为400、1000时P<0.05为差异有显著性意义。与模型组比较,编号05和编号13分别在浓度为200和400时,P<0.01为差异有非常显著性意义;在浓度为400时阳性组及编号05,P<0.05为差异有显著性意义。在浓度为800时,编号05、20,P<0.01为差异有非常显著性意义;在浓度为800时,编号09、11、13,P<0.05为差异有显著性意义。编号05、13、17、30在浓度为1000时,P<0.01为差异有非常显著性意义;在浓度为1000时,阳性组及编号20,P<0.05为差异有显著性意义。2.动物实验研究表明2.1一般情况根据一般的形态学观察,正常组的大鼠有光亮的毛色和正常的饮食。与正常组相比,模型组大鼠的饮水和饮食明显减少、毛色干枯紊乱缺乏光泽、体重增量减少甚至呈下降趋势、精神萎顿、活动减少等情况。与模型组相比,阳性组和各剂量组“牛尾巴蒿”大鼠以上一般情况均有所好转。2.2体重与正常对照组相比,模型组大鼠体重降低,P<0.01,差异有非常显著性意义。与模型组比较,阳性组体重为207.7±27.71,P>0.05,差异无统计学意义。与模型组比较,牛尾巴蒿高、中、低剂量组体重值分别为213.6±19.12g、206.6±16.66g、212.4±24.57g,P>0.05,差异无显著性意义。2.3肝脏脏器系数与正常对照组相比,模型组和各剂量组的肝脏脏器系数均明显升高。与模型组相比,阳性组和高、中剂量给药组的肝脏脏器系数均降低,高剂量组的减少最为明显,而低剂量组增加,各组间差异没有显著性意义。2.4肝纤四项指标检测与正常对照组相比,模型组各组值均降低,提示模型组发生肝纤维化。复方鳖甲软肝片阳性组与模型组比较,PC-Ⅲ降低,HA升高,P<0.05,差异有显著性意义。中、低剂量组与模型组相比,中剂量组PC-Ⅲ降低、HA升高,低剂量组的Col-IV升高,P<0.05,差异有显著性意义。与模型组相比,低剂量组LN、HA升高,P<0.01,差异具有非常显著性意义。与阳性组比较,牛尾巴蒿低剂量组LN升高,P<0.05,差异有显著性意义;其中低剂量组HA上升,P<0.01,差异有非常显著性意义。2.5血清学检测与正常对照组相比,模型组各组的值均增加,P<0.01,差异有非常显著性意义。与模型组相比,阳性组的AST和TG降低,低剂量组的TG升高,P<0.05,差异有显著性意义。与阳性组相比,中剂量组的TG和LDL-C均升高,P<0.05,差异有显著性意义。2.6肝脏病理学观察肝脏组织病理切片能够直接观察肝纤维化的形成和进展状况,也是检验肝纤维化的常用方法。在该实验中,在光学显微镜下通过CCL4复合法对大鼠肝组织进行Masson染色的结果显示,在正常对照组中:大鼠肝组织显示出清晰完整的肝小叶结构,肝索排列整齐,没有纤维组织的增生,是正常肝组织;模型组:大鼠肝组织变钝,肝小叶结构受损,纤维组织增生,中心静脉偏转或消失,肝索排列紊乱甚至断裂,肝板分离,肝窦变窄并阻塞,大量炎性细胞渗入汇管区域,并且在肝小叶的中心静脉区域和外围区域出现广泛的肝细胞球样变性。与模型组相比,阳性组的肝脏颜色偏红,颜色质量得到改善,肝细胞变性和坏死减少,纤维组织增生得到缓解。与模型组相比,佤药牛尾巴蒿高剂量和中剂量组的肝纤维化程度也适当的得到了缓解,肝细胞坏死、脂肪变性和炎性细胞浸润明显减少。在汇管纤维和网状纤维以及纤维吸收后的剩余空间中仅可见胶原的轻度增生,纤维组织增生不明显,但低剂量组纤维化水平改善不理想,细胞坏死、脂肪变性及纤维组织增生没有显著缓解,提示佤药牛尾巴蒿高、中剂量组能有效的逆转大鼠肝纤维化进程。结论1、十种不同浓度的佤药材,分别在24h、48h、72h时,均可以不同程度地对肝星状细胞HSC-T6细胞株产生抑制其增值的作用。2、牛尾巴蒿可以抑制并降低CCL4复合方法诱导的大鼠纤维化水平,降低肝脏指数、肝功指标及肝纤四项指标,具有抗肝纤维化的作用。