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心血管疾病的发病率和死亡率一直高居不下,是人类生命和健康的最大威胁之一。心血管疾病的发生发展过程复杂,相关的发病机理机制尚未完全阐述清楚。心肌肥厚和心肌纤维化参与心肌重构过程,严重的心肌纤维化会导致心功能减弱,心脏供血不足,最终心力衰竭和死亡。研究表明,微小RNA(microRNA,miRNA)参与了多种心血管疾病的发生、发展过程。miRNA通过与目标靶基因的3′-UTR端的互补序列结合,使靶基因的mRNA降解,抑制蛋白翻译,进而发挥miRNA的生物学效应。已有很多报道显示miRNA也参与了心肌纤维化的发展过程。目的:miRNA-199a-5p和mi R-199a-3p在心肌纤维化中的作用机制目前尚未明确,本文利用小鼠心肌成纤维细胞,研究miR-199a-5p和miR-199a-3p调控心肌纤维化的具体分子机制。方法:1.Ang-Ⅱ胶囊渗透泵(1.46 mg/kg/day,2周)建立C57BL/6小鼠心肌纤维化的动物模型,检测纤维化相关基因、miR-199a-5p和miR-199a-3p的表达水平。2.小动物心脏B超和Masson染色检测小鼠心脏结构、功能变化和心肌纤维化程度。3.原代分离C57BL/6小鼠心肌成纤维细胞。4.双荧光素酶报告基因实验鉴定miR-199a-5p和miR-199a-3p分别与潜在靶基因Sirt1和Smad1的结合作用。5.RT-qPCR和Western blot方法检测转染miR-199a-5p,Sirt1 siRNA后,成纤维细胞中纤维化相关基因和蛋白表达情况。6.RT-qPCR和Western blot方法检测转染miR-199a-3p,Smad1 siRNA后,成纤维细胞中纤维化相关基因和蛋白表达情况。7.重组腺病毒介导小鼠心肌纤维化中上调表达Sirt1,检测纤维化相关蛋白表达情况。8.Western blot方法检测Ang-Ⅱ激活心肌成纤维细胞中NF-κB信号通路,Smad3信号通路。RT-qPCR检测利用JSH23和QNZ阻断NF-κB信号通路、SIS3和Naringenin阻断Smad3信号通路后对miR-199a-5p,miR-199a-3p以及miR-199a转录本表达的影响。9.RT-qPCR检测转染Srf siRNA后,成纤维细胞中miR-199a-5p,miR-199a-3p和miR-199a转录本的表达。结果:1.Ang-Ⅱ灌注致小鼠心肌肥厚模型中,心脏出现明显肥大和心肌纤维化。纤维化相关基因(包括Col1a1,Col3a1,α-SMA)的mRNA水平和蛋白水平均显著增强,说明小鼠心脏出现心肌纤维化。同时RT-qPCR检测miR-199a-5p和miR-199a-3p表达均一致性表达上调。2.Ang-Ⅱ可以有效诱导小鼠心肌成纤维细胞中纤维化相关基因Col1a1,Col3a1,ACTA2的上调表达,同时检测到miR-199a-5p和miR-199a-3p表达亦显著增加。3.过表达miR-199a-5p及沉默Sirt1均能够一致性上调纤维化相关基因表达。同时利用Sirt1腺病毒提高细胞内Sirt1表达,能够有效抑制miR-199a-5p的促纤维化作用。4.证实Sirt1是miR-199a-5p作用的靶基因,miR-199a-5p可在转录水平调控Sirt11的表达。5.证实Smad1是miR-199a-3p作用的靶基因,过表达miR-199a-3p及沉默Smad1均能够一致性上调纤维化相关基因表达。6.Ang-Ⅱ可以激活NF-κB和Smad3信号通路,上调miR-199a-5p,-3p和miR-199a转录本的表达。当利用JSH23和QNZ阻断NF-κB信号通路,SIS3和Naringenin阻断Smad3信号通路时,可以降低Ang-Ⅱ诱导小鼠心肌成纤维细胞中miR-199a-5p,-3p和miR-199a转录本的表达。7.miR-199a-5p通过抑制Sirt1表达,使Smad3蛋白发生磷酸化和乙酰化水平升高,激活Smad3信号通路,发挥促进心肌纤维化作用。8.miR-199a-3p通过抑制Smad1表达,促进Smad3蛋白磷酸化,激活Smad3信号通路,发挥促进心肌纤维化作用。9.Ang-Ⅱ可以上调Srf表达,沉默Srf可以降低miR-199a-5p,-3p和miR-199a转录本的表达。结论:1.成功构建Ang-Ⅱ灌注诱导的小鼠心肌纤维化动物模型,miR-199a-5p和miR-199a-3p在心肌纤维化小鼠心肌中表达显著性上调。2.miR-199a-5p和miR-199a-3p在Ang-Ⅱ诱导小鼠心肌成纤维细胞纤维化模型中表达显著增强。3.Sirt1是miR-199a-5p作用的靶基因,Sirt1介导miR-199a-5p促进小鼠心肌纤维化。Smad1是miR-199a-3p的作用靶基因并介导miR-199a-3p促进小鼠心肌纤维化。4.miR-199a-5p和miR-199a-3p均能通过抑制对应的靶基因Sirt1和Smad1表达,Smad3信号通路,发挥促进心肌纤维化的作用。5.Ang-Ⅱ激活小鼠心肌成纤维细胞的NF-κB和Smad3信号通路,NF-κB通路和Smad3通路介导Ang-Ⅱ上调小鼠心肌细胞中miR-199a-5p,-3p和miR-199a转录本的表达。