皱纹盘鲍（Haliotis discus hanai）是我国重要的海洋经济贝类之一。近年来，随着鲍鱼养殖效益的提高，我国，特别是福建省鲍鱼的养殖数量在逐年增加。但伴随着养殖环境恶化和鲍鱼种群退化等各类原因，疾病在养殖过程中层出不穷，这给养殖户带来了巨大的经济损失，同时也使鲍鱼养殖走向了困境。研究表明，鲍鱼组织蛋白酶L是与免疫功能密切相关的蛋白质，与各类疾病的发生发展有着密切的关联。迄今为止，对于贝类中组织蛋白酶L的报道很少。本研究以皱纹盘鲍为研究对象，拟从鲍鱼内脏中分离组织蛋白酶L，并对其酶学性质和分子生物学特性进行分析，以期为鲍鱼养殖和疾病控制提供一定的理论基础。通过硫酸铵盐析、SP-Sepharose阳离子交换层析和Sephacryl-S200凝胶过滤层析等方法从皱纹盘鲍（Haliotis discus hanai）内脏中分离纯化得到组织蛋白酶L。SDS-PAGE结果显示组织蛋白酶L含分子量约为28kDa和28.5kDa的两条条带，推测为未糖基化和糖基化两种形式，分别命名为cathepsin La和Lb。肽质量指纹图谱结果表明，两个条带的结果一致，共获得95个氨基酸残基片段，与合浦珠母贝（Pinctada fucata）组织蛋白酶L的同源性均达到80%，而与杂色鲍（Haliotis diversicolor）组织蛋白酶L-like的同源性为66.7%。该酶的最适温度和最适pH分别为35°C和5.5。半胱氨酸白酶抑制剂E-64，Leupeptin和Chymostatin对其有明显的抑制作用，而金属蛋白酶抑制剂EDTA和EGTA对其有显著的激活作用。包括Cu²⁺，Fe²⁺，Co²⁺，Mn²⁺等二价金属离子对其都有一定程度的抑制作用，而Ca²⁺，Mg²⁺等有一定的激活作用。底物特异性实验表明，该酶对底物P₂位为疏水性氨基酸的底物具有较高的分解能力，其中对Z-Phe-Arg-MCA和Boc-Val-Leu-Lys-MCA具有很强的分解能力，但是并不分解组织蛋白酶B的底物。动力学实验显示，该酶对Z-Phe-Arg-MCA荧光底物的亲和力最强，K_m值为2.34μmol/L，k_cat值为24.21s^-1，对Boc-Val-Leu-Lys-MCA的K_m值为2.28μmol/L，k_cat值为16.77s^-1。利用组织蛋白酶L的多克隆抗体对鲍鱼内脏各器官中组织蛋白酶L的蛋白表达水平进行检测，结果在性腺和肝胰脏中可以检测到该酶的存在，在鳃中只能检测到少量，而在肉，外套膜和上足中均没有检测到。进一步根据肽质量指纹图谱和盘鲍（Haliotis discus discus）的EST序列标签，利用RT-PCR的方法并结合cDNA快速末端快速扩增技术（Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE）克隆得到组织蛋白酶基因序列。克隆得到的cDNA全长为1148bp，共编码326个氨基酸，其中信号肽为16个氨基酸，推测分子量为36.9kDa，等电点为6.89，命名为Cathepsin L, GenBank登录号为JX569796.1。该酶具有Cys¹³⁴， His²⁷³与Asn²⁹³残基组成的保守活性位点，存在一个潜在的N糖基化位点N位于一级结构序列的第217位。肽质量指纹图谱获得的95个氨基酸相比与克隆的序列比较发现，仅有2个氨基酸残基不同，推测本研究从蛋白水平分离纯化得到的蛋白与分子克隆基因序列编码的蛋白为同一个蛋白。预测的二级结构和三级结构表明组织蛋白酶L存在大量的α螺旋、延伸链及无规则卷曲结构。