背景与目的：食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma, ESCC),简称食管鳞癌,是我国最常见的食管癌病理类型,占我国食管癌发病总数的90%以上。ESCC的发病原因包括环境刺激及基因改变等多种因素。虽然目前关于ESCC的病因及预后目前已有不少报道,但关于能够提供早期诊断及判断预后的分子标记物仍有待进一步发现。ESCC最主要的致死原因与其侵袭性有关,因此筛选出与其肿瘤发生发展有关的新的基因,对于改善ESCC的预后有重要意义。跨损伤DNA合成途径(Translesion DNA synthesis, TLS)是细胞内的一种抗DNA损伤机制,其能够在DNA损伤存在的情况下帮助完成DNA的复制。REV3L是TLS途径中DNA聚合酶ζ (Polζ)的催化亚基,它通过在DNA损伤处插入非严格配对的核苷酸来保持DNA链的完整性,但同时也增加了基因突变及肿瘤形成的概率。有研究表明,REV3L基因多态性与肺癌及乳腺癌的发生有一定关系。还有报道显示,Potζ与宫颈癌形成及其不良预后有相当大的关系。因此,我们认为,REV3L可能对肿瘤发生及其预后判断方面有重要的意义。REV3L基因在不同肿瘤组织中表达情况各不相同。与其瘤旁组织相比,REV3L在结肠癌,肺癌,胃癌及肾癌组织中的表达是下调的,而在人脑胶质瘤中表达却是上调的。在我们的前期研究中,也发现ESCC的REV3LmRNA水平与正常组织相比明显增高。但其在ESCC发生发展过程中的作用却仍不清楚。在本项研究中,我们检测了REV3L在ESCC、癌旁组织中的表达水平,及其与临床病理参数的相关性。进一步研究了REV3L在ESCC发生发展及对化疗药物产生耐药性的可能机制。研究方法：荧光实时定量PCR检测68例ESCC及48例癌旁组织中的REV3L表达水平,并分析其与临床资料的相关性。利用免疫荧光方法从三株食管癌细胞株中选取两种REV3L表达相对较高的细胞株(TE-1和ECA-109),并进行干扰REV3L的实验。将REV3L-shRNA (shREV3L)及其对照质粒(shNC)转染到上述两种细胞株中。提取总RNA, RT-PCR判断REV3L的mRNA表达,再通过免疫荧光鉴定转染REV3L-shRNA后,转染细胞中REV3L蛋白的表达。借以判断REV3L-shRNA载体构建情况。进一步通过G418实验筛选稳定低表达REV3L的ESCC细胞株。CCK-8试验鉴定细胞增殖情况。酶标仪测定在450nm处的光密度值(OD值)。增殖力=实验组OD值／对照组OD值。在5-氟尿嘧啶(5-FU)实验中,细胞孵育24h后,加入不同浓度的5-FU再孵育48h后,同样方法测定细胞增殖力。Transwell实验进一步研究REV3L与细胞侵袭力的相关性。Transwell小室中预挂40μL基质胶。细胞在上层小室中孵育24h,经甲醛固定,结晶紫染色后,取下层小室的细胞显微镜下拍照。为了进一步研究抑制REV3L的表达是怎样降低食管鳞癌细胞的增殖与侵袭力。我们用Western Blot鉴定了上述低稳株细胞中的CyclinD1及Survivin蛋白的表达情况。流式细胞计数法分析细胞周期和凋亡：将细胞培养24h后,分别加入50μM和100μM的5-FU培养24h和48h。经PI染色-乙醇固定-PI再染色后,流式细胞仪检测细胞,数据分析使用MultiCycle软件。上述细胞经50μM和100 μM的5-FU培养48h后,在流式细胞仪上用Annexin V-PI凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡。Western blot检测细胞蛋白质水平。将全细胞提取物溶解于含蛋白酶抑制剂的RIPA溶解液中20min后,将经SDS-PAGE分离的蛋白质转移到PVDF膜上,经5%脱脂牛奶处理后,将该膜与带有β-actin、Survivin、CyclinD1和PARP的一抗一起培养。再经TBST洗涤三次后,将该膜与辣根过氧化物酶(HRP)结合的抗鼠二抗一起培养2h。最后用增强化学发光法可见所有细胞蛋白质。研究结果：我们采用qRT-PCR研究了68例ESCC组织及48例癌旁组织的REV3LmRNA表达水平。结果显示,REV3L在ESCC组织中的表达明显高于在癌旁组织中的表达(P<0.05)。REV3L表达水平与淋巴结转移及临床分期成正相关,而与患者年龄、性别、病理分级间无统计学差异。我们进一步筛选出稳定低表达REV3L的ESCC细胞株ECA-109和TE-1,并采用CCK-8试验和Transwell试验分别鉴定细胞的增殖与侵袭能力。结果显示抑制REV3L可使ESCC细胞的增殖和侵袭力下降(P<0.05)。Western blot结果显示低表达REV3L的ESCC细胞中,CyclinD1和Survivin的蛋白表达水平均明显下降。为了检测REV3L对ESCC细胞化疗耐受性的影响,我们在ECA-109和TE-1中加入用不同浓度的5-FU并培养48h,CCK-8实验鉴定细胞的生存力。我们发现用5-FU培养过的上述两种细胞株都表现出明显的剂量依赖性抑制。而低表达REV3L的细胞株则对5-FU更加敏感。用PI染色后观察到的细胞周期分析显示,与对照组相比,经不同剂量5-FU培养过24h的低表达REV3L的ECA-109细胞株有更多细胞停滞在G1期。我们还进一步研究了5-FU在低表达REV3L的细胞株中表现出的细胞毒性是否与凋亡有关。用Annexin-V染色的细胞数来鉴定凋亡程度能够分辨出早期、晚期凋亡。结果显示,ECA-109/shREV3L对不同剂量5-FU培养48h的凋亡率要明显高于对照组。PARP是目前公认的一种凋亡标记物,我们又做了western blot来分析PARP蛋白。结果显示,与对照组相比,经50 μM和100 μM的5-FU培养48h的ECA-109-shREV3L出现了更大的PARP蛋白裂隙。研究结论：REV3L过表达与ESCC细胞的增殖侵袭能力和化疗药物的抵抗性相关。抑制REV3L表达可降低ESCC细胞的增殖和侵袭能力,并可增加ESCC细胞对5-FU的化疗敏感性。因此,靶向抑制REV3L表达可能是提高ESCC细胞疗效的一项新策略。