论文部分内容阅读
猪轮状病毒(PoreineRotavirus,PRV)属于呼肠孤病毒科、轮状病毒属,它作为腹泻的主要病原在世界范围内广泛流行,是引起仔猪病毒性腹泻的主要病原之一。肠上皮细胞作为PRV感染的靶细胞可通过Toll样受体(TLRs)识别病原体相关分子模式（PAMs）激活宿主的固有免疫系统。由于轮状病毒是11节片段的dsRNA病毒，且dsRNA是TLR3的特异性配体。我们假设上皮细胞可将dsRNA作为目标而被TLR3所识别，并触发NF-κB的转录来调节诱导多种细胞因子的产生，本研究利用PRV DN30209株及Poly(I:C)体外感染IPEC-J2细胞系，观察感染前后对于TLR3、NF-κB及多种细胞因子的表达变化，探讨PRV的感染对于IPEC-J2细胞的分子致病机制。方法如下：（1）采用100TCID50的PRV与25μg/mL的Poly(I:C)分别感染IPEC-J2细胞作为感染组，于0h、1h、2h、4h、6h、12h、24h及48h后收集细胞及上清液进行下一步实验：①应用Qrt-PCR检测不同时间点的TLR3、NF-kappaB、IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α以及IFN-β的mRNA变化水平。②用ELISA法检测不同时间点的IL-1β、IL-6及TNF-α的含量变化并与对照组相比。（2）采用不同剂量的PRV（1TCID50、100TCID50、105TCID50）以及Poly(I:C)(5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL)刺激IPEC-J2细胞，于4h后收集细胞上清液。用ELISA法检测上清中IL-1β，IL-6及TNF-α的蛋白含量。（3）Western blot技术定量检测细胞核内NF-κB/p65的表达情况。结果表明：用Qrt-PCR检测PRV感染组中IPEC-J2细胞的TLR3及NF-κB的mRNA表达水平随感染时间延长而不断加强，且差异显著(P<0.05)。Poly(I:C)组的TLR3及NF-κB mRNA水平也在1h及2h时达到最高表达量。其他细胞因子的mRNA水平也在不同时间点达到上调到最高水平且与对照组（0h）相比具有统计学意义(P<0.05)。ELISA检测结果显示PRV感染组的上清液中IL-1β和IL-6的蛋白水平分别在6h和4h达到最大，而TNF-α的表达与病毒感染呈时间依赖性，Poly(I:C)感染组中的IL-1β和IL-6的蛋白水平都在6h时达到最高分泌水平(P<0.05)，TNF-α与Poly(I:C)感染同样呈时间依赖性。此外，炎性细胞因子IL-1β，IL-6以及TNF-α同PRV及Poly(I:C)的感染量呈剂量依赖型且具有统计学意义(P<0.05)。Western blot技术检测PRV可激活NF-κB的表达。结论显示PRV及Poly(I:C)可刺激诱导IPEC-J2细胞中TLR3及NF-κB的上调并影响多种细胞因子的表达。