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近年来,越来越多的研究表明,心血管疾病的发生发展与细胞凋亡有关。多种刺激均可诱导心肌细胞凋亡,如缺氧、缺血再灌注、氧化应激及肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factorα,TNFα)等。其中,TNFα可通过与心肌细胞膜上TNF-R1结合,激活死亡受体途径介导细胞凋亡。Mipu1是本实验室克隆的一个大鼠心肌缺血预适应诱导表达上调的新基因(GenBank登录号AY221750),已证实Mipu1是一个锌指蛋白型转录抑制因子。而生物信息学分析发现Bcl-2家族成员Bid基因启动子区含有Mipu1的结合位点,因此本研究旨在观察Mipu1对TNFα诱导的心肌细胞凋亡的影响,及Mipu1对Bid基因表达的调控作用,从而探讨Mipu1减轻TNFα所致H9c2心肌细胞凋亡的机制。本研究拟采用TNFα(20 ng/ml,24h)处理大鼠心肌细胞H9c2,建立细胞凋亡模型。通过瞬时转染Mipu1真核表达质粒pcDNA3.1-Mipu1,使细胞过表达Mipu1。实验分为pcDNA3.1、pcDNA3.1+TNFα、pcDNA3.1-Mipu1、pcDNA3.1-Mipu1+TNFα四组。为观察Mipu1对TNFα所致H9c2细胞凋亡的影响,采用Hoechst染色、流式细胞术(flow cytometry,FCM)及Caspase活性检测细胞凋亡百分率及Caspase8、9、3的活性;为观察Mipu1对凋亡相关基因Bid基因表达水平的影响,采用细胞间接免疫荧光术、Western-blot、RT-PCR及荧光实时定量PCR(Real-time quantitative PCR)方法检测Bid蛋白及mRNA的表达;为进一步探讨Mipu1对Bid基因转录调控的机制,采用荧光素酶报告基因及Target Detection Assay检测Bid基因转录活性及Mipu1蛋白与Bid启动子区的结合作用。主要结果如下:①TNFα处理H9c2细胞后,细胞凋亡百分率明显增加(p＜0.01 VS pcDNA3.1);瞬时转染pcDNA3.1-Mipu1后,TNFα诱导的H9c2细胞凋亡百分率增加受到明显抑制(p＜0.01 VSpcDNA3.1+TNFα)。TNFα处理后,Caspase-8和Caspase-3活性明显增加(p＜0.01 VS pcDNA3.1);转染pcDNA3.1-Mipu1后,TNFα诱导的Caspase-8和Caspase-3活化明显减少(p＜0.01 VSpcDNA3.1+TNFα);而Caspase-9的活性在各组间比较无明显差异。②细胞间接免疫荧光实验发现,瞬时转染pcDNA3.1-Mipu1后,H9c2胞浆中Bid蛋白表达明显减少。Mipu1过表达使基础状态下的Bid蛋白及mRNA表达水平下调(p＜0.05 VS pcDNA3.1);细胞经TNFα处理之后,Bid蛋白及mRNA表达水平升高(p＜0.05 VS pcDNA3.1),Mipu1过表达使TNFα诱导的Bid蛋白及mRNA表达水平下调(p＜0.05 VS pcDNA3.1+TNFα);并且随着pcDNA3.1-Mipu1转入的增多,Bid蛋白表达水平逐渐下降,两者呈量效关系。③Mipu1过表达使基础状态下的Bid基因转录活性下调(p＜0.05 VS pcDNA3.1);细胞经TNFα处理之后,Bid基因转录活性明显升高(p＜0.01 VS pcDNA3.1),Mipu1过表达使TNFα诱导的Bid基因转录活性明显降低(p＜0.01 VSpcDNA3.1+TNFα);并且随着pcDNA3.1-Mipu1转入的增多,Bid基因转录活性逐渐下降,两者呈量效关系。并且Target Detection Assay发现Mipu1纯化蛋白能与Bid基因启动子区结合。因此我们得出以下结论:①Mipu1过表达可抑制TNFα所致的H9c2细胞凋亡,其机制与Mipu1抑制Caspase-8和Caspase-3的活化有关。②Mipu1可抑制Bid基因的表达,其机制与Mipu1结合到Bid启动子区直接调控Bid基因的转录表达有关。