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B7-H3是新近发现的共刺激分子,属B7超家族成员,为I型跨膜球蛋白,分子量约45～66kD,编码361个氨基酸。B7-H3mRNA表达谱相当广泛,表达在除外周血淋巴细胞及骨髓组织外的几乎所有组织上。在生物学功能上,B7-H3可促进T细胞活化增殖和IFN-γ的分泌,增强CTL活性,对TNF-α及IL-8的分泌也有适度促进作用。在肿瘤免疫应答中,B7-H3信号能有效的激发T细胞特别是激发CD8~+T细胞介导的抗肿瘤效应。但随后也有研究表明,B7-H3介导的信号可抑制T细胞的体外增殖,降低IFN-γ的分泌。此外,B7-H3信号在骨质疏松的发生、在移植物排斥反应(allograft rejection)中都具有重要的调节作用。因此,对该信号途径的有效调节将不仅为理解复杂、精细的免疫应答提供新的视角,而且还具有潜在的临床应用前景。本项研究旨在通过研制B7-H3融合蛋白及特异性单克隆抗体,继而从不同水平探讨B7-H3分子在免疫应答的调节作用和涉及的机制。 1.人B7-H3分子的克隆、重组蛋白的表达及其生物学功能的研究 采用RT-PCR的方法,从人的肺组织克隆得到了人B7-H3的cDNA。以此为模板,利用PCR技术,克隆编码人B7-H3胞外段的功能区基因。将测序正确的该基因装入原核表达载体pGEX-5X-3/hB7-H3。然后将该重组载体导入表达宿主菌BL21(DE3),异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生GST/hB7-H3融合蛋白。经过GST-Sepharose亲和层析纯化变性复兴后得到的可溶性蛋白,MTT法证明此蛋白对T淋巴细胞的体外增殖具有明显的促进作用。ELISA分析发现,该融合蛋白可明显地提高T细胞对INF-γ和IL-10的分泌。 2.鼠抗人B7-H3单抗的制备、特性分析及B7-H3蛋白表达谱的研究 通过基因克隆,将编码人B7-H3分子的cDNA插入逆转录病毒载体pEGZ-Term。进一步通过脂质体转染技术将重组表达载体与辅助病毒载体共转染包装细胞293T,用其培养上清感染L929细胞,经Zeocin筛选获得稳定表达B7-H3分子的L929转基