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二肽基肽酶样蛋白6（Dipeptidyl peptidase-like protein 6,DPP6）可作为辅助亚单位与钾通道相互作用蛋白（K+channel-interacting protein 2,KCh IP2）共同构成心脏电压门控性钾通道4（Voltage gated potassium channel 4,Kv4）,成为瞬时外向钾电流(Transient outward potassium current,Ito)的分子基础。Ito是包括人在内的大型哺乳动物心室复极1期的电流成分,近年发现DPP6基因突变使Ito增大可引发家族性特发室颤（Idiopathc ventricular fibrillation,IVF）。因此研究DPP6对心脏Kv4通道的功能调节与机制具有重要意义。既往研究表明,DPP6可与Kv4亚单位结合直接调节通道门控来影响通道功能,并有初步的实验证明DPP6可能影响Kv4通道膜蛋白的表达量,但其作用机制尚不清楚。已知膜蛋白的表达量取决于基因转录、蛋白合成以及蛋白上膜和内吞等过程。并且心脏Kv4通道是三元复合体,其中KCh IP2作为转录因子调控Kv4.3的基因转录,并促进Kv4通道的正向转运,当靶向敲除KCh IP2时,Ito基本消失。但DPP6对Kv4膜蛋白表达量的作用是否依赖于KCh IP2以及DPP6的作用环节等问题目前尚不清楚。已知DPP6存在不同亚型,以DPP6-S与DPP6-L最为常见。我们课题组前期研究发现小分子磺酰脲类化合物NS5806可能通过与DPP6的胞内位点结合调节心脏Kv4通道功能,且因DPP6-L、DPP6-S亚型的不同而发挥相反的调节作用。然而目前心脏DPP6亚型尚不明确。基于上述问题,本研究拟采用液相色谱串联质谱分析（Liquid Chromatograph Mass Spectrometer/Mass Spectrometer,LC-MS/MS）明确大鼠左心室DPP6亚型;并分析DPP6对Kv4.3膜蛋白表达的调节作用,为探索DPP6在心脏Kv4通道的生理及病理生理意义提供初步实验依据。目的:本课题旨在确认大鼠心脏的DPP6亚型,分析DPP6在Kv4.3钾通道蛋白表达中的作用。方法:1.大鼠左心室中DPP6亚型表达鉴定:采用LC-MS/MS分析方法,检测大鼠左心室中DPP6-L和DPP6-S各自的唯一肽段,测定DPP6-L和DPP6-S的蛋白相对含量。采用q RT-PCR技术检测大鼠左心室心肌中DPP6-L与DPP6-S的m RNA相对含量。2.DPP6对Kv4钾通道表达量的调节与机制:在异源表达系中,采用q RT-PCR技术和Western Blot技术分别分析DPP6对Kv4.3的m RNA相对含量和蛋白（包括全蛋白及膜蛋白）的表达量影响。构建双色荧光标记Kv4.3质粒,利用流式细胞术观察DPP6对Kv4.3蛋白转运影响,进一确定DPP6对Kv4.3通道蛋白转运影响。此外,观察两个DPP6突变体（L747P和Q526H）对Kv4.3蛋白表达量的影响。结果:1.大鼠左心室中DPP6亚型分析:在蛋白水平上,通过LC-MS/MS分析方法,我们搜索到了4条DPP6-L的唯一肽段,2条DPP6-S的唯一肽段,且DPP6-L的基于强度绝对定量值（intensity-based Absolute Quantification,i BAQ）远高于DPP6-S,表明大鼠左心室中DPP6以DPP6-L的形式为主。m RNA定量结果显示,大鼠脑组织中DPP6-S的m RNA含量远高于DPP6-L（P<0.05）;大鼠左心室组织中DPP6-L与DPP6-S的m RNA远低于脑组织表达量,但L、S亚型m RNA含量无差异（P>0.05）。2.DPP6对Kv4钾通道表达的调节与机制:在m RNA水平,与单独表达Kv4.3相比,DPP6和KCh IP2分别与Kv4.3共表达时均不影响Kv4.3的m RNA表达（P>0.05）。在蛋白水平,与单独表达Kv4.3相比,DPP6与Kv4.3共表达时不影响Kv4.3全蛋白表达量（P>0.05）,但可以增加Kv4.3膜蛋白表达量（P<0.05）。与单独表达Kv4.3相比,KCh IP2与Kv4.3共表达时可以增加Kv4.3全蛋白及膜蛋白表达量（P<0.05）。但在共表达KCh IP2、Kv4.3的基础上同时表达DPP6,与共表达KCh IP2和Kv4.3相比,前者Kv4.3全蛋白表达量低于后者（P<0.05）,且前者Kv4.3膜蛋白表达量与后者无差异（P>0.05）。流式细胞分析孵育Dynasore（马达蛋白抑制剂抑制膜蛋白内吞）后Kv4.3膜蛋白动态变化,结果显示,与单独表达Kv4.3相比,DPP6与Kv4.3共表达,Kv4.3通道蛋白上膜程度随时间延长而增加的更多（P<0.05）。进一步表明DPP6具有促进Kv4.3正向转运过程的作用。3.DPP6突变体对Kv4.3通道蛋白表达的影响与DPP6-WT相比,DPP6-L747P和DPP6-Q526H对Kv4.3全蛋白表达量无明显影响（P>0.05）;但膜蛋白表达量显著增加（P<0.05）。结论:1.大鼠左心室心肌中DPP6主要以DPP6-L的形式存在。2.DPP6与KCh IP2的作用存在差异。一是作用模式不一样:DPP6参与调节Kv4.3的转录后过程,其作用不依赖于KCh IP2,并促进Kv4.3的正向转运,并且DPP6可以削弱KCh IP2增加Kv4.3全蛋白表达量的作用。二是作用强度不一样:DPP6的作用微弱远不及KCh IP2对Kv4.3通道的调节作用,并且可被KCh IP2的强大作用所掩盖。3.两个引发家族性室颤的DPP6突变体DPP6-L747P和DPP6-Q526H,相较于DPP6-WT可显著增加Kv4.3膜蛋白表达量。这可能是gain of function突变的主要机制。