【摘 要】
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为建立一种可同时检测和鉴别4种鸡球虫的快速、简便、灵敏度高、特异性强、重复性好的多重PCR方法,为鸡球虫病流行情况调查提供方法。本研究通过筛选不同种球虫种内保守、种间特异的基因片段,设计合成特异性引物,建立四重PCR检测方法;通过对多重PCR影响较大的退火温度、引物添加量、延伸时间、循环次数进行优化,以确定最适多重PCR扩增体系与条件;通过优化球虫卵囊DNA提取方法,以确定球虫最佳破壁条件和球虫裂
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（31972647）；
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为建立一种可同时检测和鉴别4种鸡球虫的快速、简便、灵敏度高、特异性强、重复性好的多重PCR方法,为鸡球虫病流行情况调查提供方法。本研究通过筛选不同种球虫种内保守、种间特异的基因片段,设计合成特异性引物,建立四重PCR检测方法;通过对多重PCR影响较大的退火温度、引物添加量、延伸时间、循环次数进行优化,以确定最适多重PCR扩增体系与条件;通过优化球虫卵囊DNA提取方法,以确定球虫最佳破壁条件和球虫裂解液成分;通过对该方法的灵敏性、特异性和重复性进行验证以确定该方法。试验结果表明:1.以堆型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫各自的ITS-1基因和毒害艾美耳球虫RAPD-SCAR标记筛选基因作为四个靶基因设计合成的引物,PCR产物分别为294 bp、454 bp、137 bp、230 bp,与目标基因序列的相似性为99.60%、99.24%、96.97%和98.98%,未扩增出非目标产物,四对PCR引物均特异。2.四种艾美耳球虫的梯度PCR产物均随退火温度（45～63℃）的增高先增多,60.2℃和61.6℃最多,后又减少,且温度低于58.2℃出现非目标产物条带;多重PCR产物均随其引物浓度增高而增多,但引物浓度≥0.75μL（0.3μmol/L）时,各虫株的PCR产物量均不再增加;多重PCR产物均随延伸时间的延长而增多,当延伸时间≥60 s时,目的条带亮度不再增加;在30～40个循环范围内,多重PCR产物均随循环次数的增加而增多,且未出现非特异性条带。3.球虫卵囊机械破壁条件玻璃珠用量（A）、玻璃珠大小（B）、研磨转速（C）、研磨时间（D）的最大k值分别为A2、B1、C3、D3,故最优水平为A2B1C3D3;添加10 mmol/L EDTA的球虫裂解液,蛋白酶k消化20 min,煮沸2 min收得的球虫DNA粗提物PCR产量（T3）显著高于（P＜0.05）煮沸10 min组（T2）和6 mmol/L EDTA组（T1）。4.单重PCR与四重PCR检测堆型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫DNA模板浓度≥1个卵囊/μL,毒害艾美耳球虫DNA模板浓度≥10个卵囊/μL时出现特异性目标条带。对纯化的球虫卵囊在检测限范围内其灵敏性、特异性和重复性均达100%。总之,成功构建了能同时检测柔嫩艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫的四重PCR测定方法,其具有特异、检测限低（1～10个卵囊/μL）、灵敏和重复性好的特性。建立了可在74min内提取获得球虫DNA粗提物的球虫裂解液。
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