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采用蛋白质工程手段对酶进行分子改造使其具备或提高某种功能,是利用酶实现工业催化与转化的前提。为获得靛蓝产量提高的生物催化剂,本论文通过定向进化,半理性设计,定点突变等技术对P450 BM-3进行体外改造,构建文库,并采用改进的筛选方法对文库进行筛选,最终获得了一系列催化能力提高的突变酶；继而在分子水平解析突变酶结构与功能的关系。首先,本文改进了用于筛选催化靛蓝能力提高突变酶的初筛方法,即通过乳糖/吲哚-LB液体筛选培养基结合96孔板对突变酶进行筛选。该方法基于摇瓶中乳糖诱导P450BM-3表达的条件,在普通LB液体培养基中预先加入2.0g/L的乳糖,并添加终浓度0.5 mM的吲哚。采用此法可以在12 h内观察到培养基颜色变化,选取蓝色深于父本的突变株,其靛蓝合成能力也可能较好。相比以往的筛选方法,该法筛选周期短,显色反应稳定性好,且具有足够的分辨能力,可以实现对P450 BM-3的突变文库更加快捷、高效的筛选。该方法能够较好的用于筛选的可能原因在于：乳糖促进了P450 BM-3的可溶性表达,改变了P450 BM-3在上清液及包涵体中的比例。摇瓶表达时,可溶性P450 BM-3的总量达到80 mg/L左右,为IPTG诱导下的2.3倍；包涵体比例则由IPTG诱导下的25%左右下降至9%以内。乳糖促进P450 BM-3可溶性表达的更深层次原因在于：乳糖适当降低了诱导强度,有利于分子伴侣及其他折叠相关蛋白的合成,反过来,这些分子伴侣保证了目标蛋白的正确折叠,从而有效的降低了包涵体比例。随后,利用该初筛方法对构建的P450 BM-3的168/435位点突变组合文库及易错文库进行了筛选。168/435位点突变组合文库中最有利于靛蓝生成的突变酶为D168L/E435T,该突变酶转化数提高至父本的6.6倍；Km较父本降低16%,催化效率提高至父本的7.9倍；此外,该突变酶对NADPH的利用率获得提高,并且在催化底物吲哚的区域选择性上更有利于3-羟基吲哚的生成,主产物靛蓝比例得到进一步提高。该突变酶的168位点突变与435位点突变存在对靛蓝合成的协同作用,其中168位点的突变可能主要影响底物结合,而435位点位于底物识别区域,更多影响的是酶的催化性能。通过对易错文库12000株单菌落的筛选,最终获得了突变酶V445A具有最优的靛蓝生产潜力；通过在445位点饱和突变,最终确认丙氨酸为该位点的最佳氨基酸替代形式；突变酶V445A的Km较父本下降9.2%,而转化数提高为父本的7.5倍,催化效率因此提高至父本的8.2倍；电子耦合率较父本提高28.2%,副产物靛玉红的比例也降为父本的60.5%。研究发现,445位点最低的疏水性导致最佳的催化性能,提高该位点的疏水性或亲水性都会降低蛋白的催化能力；突变酶V445A催化活力提高的原因可能是由于Ala445的突变影响了附近底物识别位区域(SRS6)的结构,从而导致有利于底物进入及产物释放的结构变化。最后,通过在突变酶D168L/E435T基础上叠加V445A突变,获得了三位点突变酶D168L/E435T/V445A,其催化性能进一步提高。突变酶D168L/E435T/V445A对底物的亲和力较组合前以及父本有所下降,但其转化数大幅提高为父本的17.3倍,因而其催化效率也提高为父本的12.0倍；突变酶对NADPH的利用率获得提高,电子耦合率达到24.7%,是父本的2.1倍；突变酶在催化吲哚的区域选择性上,更有利于靛蓝生成,使副产物靛玉红比例由父本的8.1%降为1.5%。从分子水平对该突变酶进行分析,该突变酶靛蓝合成能力提高的可能原因在于：445位上发生的疏水性丙氨酸置换,对酶的整体结构起到了微调作用,正是这个微调造成的适度的疏水性变化,因而导致Ala445与Thr435及Leu168作用分别加成,Ala445与Thr435位点构象产生有利于底物进入通道并促进产物释放的协同作用,使得催化能力大幅提高；而Ala445也加剧了168位点不利于底物结合的效应,使得底物亲和力稍有下降。但总体上这两种效应以促进催化为主,因而导致催化效率不但没有下降,反而大幅提高。