目的:本研究以络病理论为指导,以血管内皮功能障碍为切入点,建立病证结合络气虚滞中医证候动物模型与细胞模型,从整体与细胞水平探讨络气虚滞型血管内皮功能障碍的病理生理基础,并研究不同类别通络方药的干预作用。血管内皮功能障碍(endothelial dysfunction,ED)系血管内皮细胞在多种病理因素(如高血压、高血脂、糖尿病、吸烟、压力等)刺激下失去正常功能的病理过程,与氧化应激、免疫损伤及炎症机制关系密切,主要表现为内皮依赖性舒张功能障碍及血管活性物质分泌紊乱,是心脑血管病发生的始动因素和重要环节。中医学认为血液在血管中正常运行需要气的推运,气虚运血无力或气滞血运不畅均可导致血液运行障碍及血管病变。基于络病理论研究的“三维立体网络系统”,广义络脉分为气络和脉络,脉络运行血液,其解剖形态与现代医学血管系统具有同一性,由此而提出“脉络-血管系统病”(vessel-collateral and vascular system disorders, VCVSD)概念;气络运行经气,发挥温煦充养、防御卫护、信息传导、调节控制作用。络气虚滞(stagnancy of collateral-qi in a deficiency condition, SCQDC)是脉络病变由功能性病变向器质性病变发展的早期阶段,其引起的脉络自适应、自调节、自稳态功能失常,为“脉络-血管系统病”(vessel-collateral and vascular system disorders, VCVSD)始动因素并贯穿和影响病变的全过程,与血管内皮功能障碍具有内在一致性,也涵盖了西医学更广泛的神经-内分泌-免疫网络调节功能异常对血管病变的影响。这启发我们将中医气血相关的络病理论特色与现代微观研究有机结合,探讨“络气虚滞”状态下NEI网络调控失常变化规律及其与血管内皮功能障碍之间的内在联系,并探索不同类别通络方药的干预机制。方法:本研究采用同型半胱氨酸制作血管内皮功能障碍的基础模型,在此基础上应用“基础进食+强迫负重游泳”诱发气虚证候的方法,建立络气虚滞型血管内皮功能障碍病证结合的动物模型。以通过临床流行病学调查建立的“脉络—血管系统病”证候诊断标准为基准,分别从中医证候学、血管内皮功能变化及血管舒缩反应性改变等方面对所建模型进行评价,并应用单味益气中药、益气活血组分配伍方药、通络复方从不同层次进行通络反证。以此为实验平台,探讨络气虚滞状态下NEI网络的变化规律及其与血管内皮功能障碍之间的内在相关性,以及通络方药改善血管内皮功能的作用机制。同时培养人脐静脉内皮细胞株ECV-304,通过加入络气虚滞型内皮功能障碍模型大鼠血清,建立体外络气虚滞型内皮细胞损伤模型,并应用上述不同通络方药进行干预,在细胞水平上进一步探讨络气虚滞型血管内皮细胞的损伤机制及通络方药的影响。1络气虚滞血管内皮功能障碍模型的建立及通络方药的干预作用本部分实验首先采用高蛋氨酸饮食诱发高同型半胱氨酸血症建立血管内皮功能障碍模型,以“基础进食+强迫负重游泳”法诱发气虚证候,并以人参、双参、通心络超微粉三种通络药物进行干预,建立络气虚滞病证结合动物模型,观察并记录实验动物的证候学表现、检测血管内皮功能及血管内皮依赖性舒张反应的变化。将清洁级健康雄性Wistar大鼠,160只随机分为6组(每组30只):①对照组:正常饮食,每日等量0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)灌胃;②HCY组:喂饲3%高蛋氨酸饲料(不限食),不限饮水,每日等量0.5%CMC-Na灌胃;③络气虚滞组:高蛋氨酸饲料喂养4周后,于基础饮食条件下开始强迫负重(自身体重的5%)游泳;④人参组:于喂饲高蛋氨酸饮食开始即给予人参(1ml/100g)腹腔注射,给药浓度为0.008 g生药/ml;⑤双参组:于喂饲高蛋氨酸饮食开始即给予双参(1ml/100g)腹腔注射,给药浓度为:0.075 g生药/ml;⑥通心络组:于喂饲高蛋氨酸饮食开始即给予通心络(1ml/100g体重)灌胃,给药浓度为:0.06g生药/ml。每日观察大鼠的一般情况,各组(HCY组动物除外)于末次给药30min后行耐力检测;每组取3只动物,分离胸主动脉,检测血管内皮依赖性舒张功能;每组取3只动物,分离肠系膜,同时尾静脉快速注射乙酰胆碱水溶液(40μg/kg),检测微血管扩张;其余大鼠于造模后,禁食7h,检测血浆血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、内皮素(ET)、血栓素A2 ( TXA2)、前列环素I2 (PGI2)水平,血清MDA、NO含量及SOD、GSH-PX活性,光镜和透射电镜观察各组大鼠胸主动脉形态学变化;免疫组织化学染色方法检测胸主动脉组织中血管紧张素转化酶(ACE)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、血管紧张素Ⅱ一型受体(AT1)、内皮素受体(ET1)、过氧亚硝基阴离子(ONOO-)表达。结果:①与对照组和HCY组比较,络气虚滞大鼠精神萎靡,眼睑下垂,反应迟钝,毛发枯槁,体重显著下降,皮下少有脂肪,甚至抓之触骨,鼻尾颜色苍白,大便不成形或稀溏;爬竿时间(85.25±73.52s )明显低于对照组(128.88±49.27s)(P<0.05)。各治疗组大鼠一般情况改善,体重稳定并有增加趋势,爬竿时间延长。②HCY组大鼠血浆AngⅡ含量(140.31±20.43 ng/ml)较对照组(70.27±10.09ng/ml)明显升高(P<0.01),ET、TXA2(对照组:58.49±8.48pg/ml、224.58±112.58 pg/ml; HCY组: 75.93±4.29pg/ml、509.96±323.79pg/ml)呈现升高趋势,PGI2含量(144.44±157.46pg/ml)则较对照组(216.29±64.94pg/ml)有降低趋势,但无统计学差异;与对照组(27.90±12.93μmol/l)比较,HCY组NO水平(14.93±5.03μmol/l)显著降低( P < 0.05 )。络气虚滞组血浆AngⅡ、ET-1、TXA2水平(306.13±127.87ng/ml、80.31±12.74pg/ml、509.96±323.79pg/ml)较对照组明显增高(p<0.001,p<0.05,p<0.001),PGI2含量(104.57±31.56 pg/ml)则明显下降(P<0.01),NO含量(8.91±3.02μmol/l)亦明显低于对照组(p<0.001),同时与HCY组比较,络气虚滞组AngⅡ含量也明显升高(p<0.05)。三种通络药物干预后,与络气虚滞组比较,人参组血浆AngⅡ、ET-1显著降低(p<0.01,p<0.05),血清NO含量显著升高(P<0.05),PGI2水平有升高趋势但无统计学差异。双参组AngⅡ、ET-1水平显著降低(p<0.01,p<0.001),TXA2含量虽降低但无显著性差异, NO含量明显升高(p<0.05),通心络组AngⅡ、ET-1水平显著降低(p均<0.001), NO含量明显升高(P<0.01),而血浆中TXA2、PGI2水平分别呈现出下降和上升趋势,但无统计学差异。HCY组MDA水平( 5.14±1.16 nmol/ml)与对照组(4.38±1.25nmol/ml)比较,虽有升高趋势但无统计学意义,而络气虚滞组血清MDA含量(11.44±2.80 nmol/ml)则显著升高(p<0.001),两组GSH-Px与SOD活性(HCY组:1755.00±687.23 U/ml、293.54±12.74U/ml;络气虚滞组:1475.78±242.89U/ml、195.84±50.29 U/ml)亦显著低于对照组(2409.58±341.84U/ml、275.52±20.08 U/ml)(p<0.05,p<0.001)。人参组和通心络组血清MDA含量明显降低(p<0.001),而双参组虽有降低趋势但无统计学差异,人参组SOD、GSH-Px的活性均明显升高(p<0.05,p<0.01)。双参组大鼠SOD活性明显高于络气虚滞组(p<0.05),而GSH-Px活性虽高于络气虚滞组但无统计学差异。通心络组SOD和GSH-Px的活性均呈现不同程度的升高,具有统计学差异(p<0.05,p<0.01)。③光镜显示,HCY组胸主动脉平滑肌层轻度水肿,内膜下轻度增生,络气虚滞组胸主动脉平滑肌层轻度水肿,并有轻度的炎性细胞浸润,平滑肌细胞排列紊乱,三种通络方药干预后大体结构基本接近正常。电镜显示,血管内皮细胞线粒体部分嵴和膜融合甚至消失,粗面内质网呈现不同程度脱颗粒,吞饮小泡数量减少,核膜外层及部分内层膜融合,可见Weibel- Palade(WP)小体;络气虚滞组血管内皮细胞游离面微绒毛及吞饮小泡数量显著减少,线粒体大部分嵴和膜融合甚至消失,粗面内质网严重脱颗粒,三种通络方药可不同程度减轻上述超微结构的改变。免疫组织化学染色结果显示,HCY组主动脉组织中ACE、AT-1、ET-1、ONOO-表达增强,黄染信号可见于细胞胞质中,且以动脉组织外层和内层(包括内皮细胞)为主。络气虚滞组eNOS表达较对照组和HCY组明显减弱,而ACE、AT-1、ET-1、ONOO-表达明显增强,三组通络方药可从不同程度上减弱ACE、AT-1、ET-1、ONOO-表达,增强eNOS表达。④各组动脉及微血管的舒张反应性(舒张百分比)结果显示,HCY组(0.707±0.299)和络气虚滞组(0.501±0.176)离体血管环内皮依赖性舒张百分率较对照组(1.024±0.184)均显著降低(p<0.05,p<0.001)。与络气虚滞组比较,人参组、双参组、通心络组离体血管环舒张百分率均不同程度上升(0.641±0.114、0.825±0.151、0.977±0.342)(p<0.01,p<0.05,p<0.01)。另外,HCY组和络气虚滞组微血管(肠系膜毛细血管)扩张幅度及扩张百分率(1.67±0.23μm、14.34±3.19%;0.95±0.33μm、10.74±3.26%)较对照组(4.50±0.94μm;55.61±28.62%)显著降低(p<0.05,p<0.01,p<0.001)。与络气虚滞组比较,人参组、双参组、通心络组微血管扩张幅度(2.35±1.24μm、2.23±0.38μm、3.76±0.92μm)均不同程度上升(p<0.05,p<0.01),微血管扩张百分率亦上升,以通心络组效果最显著(p<0.05)。结果提示以蛋氨酸饮食复合“基础饮食+负重游泳”动物表现出的精神萎靡,毛发枯槁,体重下降等一般状况符合临床络气虚滞证候诊断标准,同时血管内皮功能障碍较HCY组进一步加重,表明所建立的络气虚滞型血管内皮功能障碍模型成功。不同层次通络方药干预后,上述表现可不同程度改善。2络气虚滞型血管内皮功能障碍模型大鼠NEI网络变化及通络方药干预作用以实验1建立的络气虚滞型血管内皮功能障碍动物模型为平台,放免法检测血浆CRH、ACTH、GC、PRA、Ang II、ALD及血清中IL-1β、IL-2、IL-6;ELISA法检测NE、IL-10,生物化学方法检测血清免疫球蛋白IgG、IgA、IgM及补体C3、C4水平,计算胸腺和脾脏指数,探讨NEI网络相关指标变化规律,运用生物信息学方法分析该模型血管内皮功能障碍指标与NEI网络指标之间的联系。实验所用动物、分组、给药及标本留取方法同前。结果:(1)PRA - ANG -ALD系统:与对照组(0.865±0.251pg/ml)相比, HCY组和络气虚滞组血浆肾素水平(0.590±0.175 pg/ml、0.403±0.125 pg/ml)显著降低(P<0.01), Ang II水平(140.301±20.431 pg/ml、306.12±127.867pg/ml)均较对照组(70.269±10.090pg/ml)显著提高(P<0.01,P<0.001),与HCY组比较,络气虚滞组AngII明显升高(P<0.05);三种通络药物干预后,血浆肾素水平均呈现不同程度的升高,但并无统计学差异;血浆AngI(I人参组:202.563±49.169 pg/ml、双参组:212.490±46.364 pg/ml、通心络组:172.748±53.356 pg/ml)呈现不同程度下降趋势(P<0.01,P<0.01,P<0.001),血浆ALD均有不同程度上升,通心络组(0.834±0.255 ng/l)明显高于对照组及络气虚滞组(P <0.05),且此作用优于人参组(0.500±0.376 ng/l)(P<0.05)。(2)CRH-ACTH-GC功能轴:与对照组(CRH: 4.195±0.599ng/ml、GC: 13.921±1.142μg/l)比较,HCY组血浆中CRH(4.769±1.913 ng/ml)、GC(15.584±1.926μg/l)均呈现出升高趋势,但无统计学差异(p>0.05),ACTH水平变化亦不甚明显。络气虚滞组血浆CRH(6.548±1.620 ng/ml)显著增高(p<0.01),且明显高于HCY组(p<0.05),同时血浆ACTH(3.918±0.333pg/ml)与GC水平(10.320±2.992μg/l)均较对照组(ACTH:4.431±0.762 pg/ml)明显下降(p <0.05),GC水平显著低于HCY组(p<0.01)。三种通络方药干预后,CRH水平不同程度降低,其中双参组和通心络组优于人参组(5.370±1.599 ng/ml、4.494±0.802ng/ml、4.383±1.100 ng/ml)(p <0.01);ACTH水平具有升高趋势,但无统计学差异,其下游的GC水平(人参组:13.953±2.800μg/l、双参组:14.357±2.528μg/l、通心络组:20.576±5.684μg/l)出现不同程度升高(p<0.001,p<0.01,p<0.001)。另外,与对照组比较,HCY组和络气虚滞组血浆NE水平均升高。三种通络药物干预后,NE水平具有下降趋势,但无统计学差异。(3)免疫系统:①免疫球蛋白家族:与对照组比较,HCY组IgG、IgA明显升高(p<0.05, p<0.01), IgM虽有升高趋势,但无统计学差异,同时HCY组和络气虚滞组两组补体C3、C4含量均显著下降(p <0.001),与HCY组比较,络气虚滞组IgG、IgA含量下降(p<0.05, p<0.001),通心络组补体C4水平较络气虚滞组显著升高(p<0.05)。②白介素家族:与对照组比较,络气虚滞组IL-1β、IL-6水平显著升高(p <0.01),同时高于HCY组(p<0.001, p<0.01),HCY组IL-10水平虽有升高趋势,但无统计学差异。三种通络药物干预后,双参组和通心络组IL-1β水平较络气虚滞组呈现不同程度降低(p<0.01)。与络气虚滞组比较,通心络组IL-6含量明显降低(p<0.05)。③胸腺与脾脏:与对照组比较,HCY组和络气虚滞组胸腺指数不同程度减小,具有统计学差异(p<0.05, p<0.001),脾脏指数较对照组明显升高(p<0.05)。三种通络方药后,胸腺指数不同程度升高,有统计学差异(p<0.01,p<0.01,p<0.05),脾脏指数不明显。(4)生物信息学分析结果显示:络气虚滞组NEI网络指标CRH、ACTH、GC及ALD与内皮功能指标ET之间;AngⅡ、IL-1与ET之间;ALD与PGI2之间;ALD与NO之间分别构成了4个相互独立的系统,他们之间均是按照复杂系统的最优化原则发生相互联系,并存在递变规律。正常对照组、HCY组、通络干预组不存在这种子系统之间的相互联系,提示过劳伤气是导致NEI网络紊乱的主要因素,络气虚滞型血管内皮功能障碍可能与NEI网络稳态失衡存在着密切相关性,后者可能是该状态下血管内皮功能障碍发生、发展的病理生理学基础之一。实验结果提示,HCY组血管内皮功能受损,AngII升高,与HCY组比较,络气虚滞组AngII升高尤为明显,显示络气虚滞是AngII上升的重要因素。同时看到,肾素、醛固酮下降,RAAS系统并未激活,而NE与AngII呈现出同步升高的密切关系,提示交感神经兴奋是AngII升高的主要原因,同时伴有胸腺萎缩,炎症因子表达升高,这反映“过劳伤气”所致植物神经功能失调在血管病变中起着重要作用。而NEI网络调节功能出现了严重紊乱,主要表现为下丘脑机能偏亢,受其调节的垂体功能反而低下,同时该功能轴靶腺肾上腺皮质功能也表现出低下,从另外一个角度提示NEI网络的稳态失衡可能是络气虚滞型血管内皮功能障碍发生发展的病理生理学基础之一。3络气虚滞大鼠动脉组织JNK/c-Jun /HO-1/CO通路的变化及通络方药的干预作用3.1络气虚滞大鼠胸主动脉HO-1/CO的改变及通络方药的干预作用本部分对络气虚滞大鼠动脉组织CO与诱生型合成酶HO-1基因和蛋白表达进行检测,并观察通络方药的影响。大鼠随机分为①对照组:0.5%CMC-Na灌胃;②络气虚滞组;③人参组;④双参组;⑤通心络组。其中②、③、④、⑤组的干预方法同实验1。实验结束后30min处死动物,留取动脉组织,采用连二亚硫酸钠法、RT-PCR、westernblot、免疫组织化学技术分别检测各组动脉组织中CO含量及HO-1mRNA和蛋白表达,并利用免疫荧光双重标记共聚焦显微镜观察在HO-1细胞内的定位。结果:络气虚滞组COHb含量显著下降(p<0.01),HO-1mRNA和蛋白表达下调(p<0.01, p<0.001),其阳性信号主要分布在内皮细胞以及血管平滑肌细胞等的胞浆内,三种通络方药干预后, HO-1mRNA呈现不同程度上升趋势,其蛋白水平表达均显著升高(p<0.001),通心络组在蛋白调控水平上优于人参和双参组(p<0.001),并显著提高组织中的CO含量(p<0.05)。结果提示通络方药可通过改善或修复HO系统进而诱导内源性CO的产生来发挥抗氧化、改善血管舒张和收缩功能等作用,从而改善络气虚滞时所伴发的血管内皮功能障碍。3.2 JNK/c-Jun通路在络气虚滞大鼠动脉组织中的变化及通络方药对此的影响本部分实验动物及分组同3.1,采用RT-PCR、western blot、免疫组织化学技术分别检测各组动脉组织中JNK、c-Jun mRNA和蛋白表达以及c-Jun的磷酸化情况,并利用免疫荧光双重标记共聚焦显微镜观察在细胞内的定位。结果:①RT-PCR检测发现,与对照组比较,络气虚滞组JNK和c-Jun mRNA水平(19.67±4.163, 26.33±6.110)均显著降低(P<0.001);双参和通心络组可使JNK和c-Jun mRNA水平不同程度升高(P<0.05, P<0.01, P<0.001 );western blot检测表明,与对照组比较,络气虚滞组JNK和磷酸化c-Jun水平( 33.67±2.082 , 23.00±1.000 )均降低(P<0.001);三种通络方药可使JNK和c-Jun磷酸化水平明显高于络气虚滞组(P<0.01, P<0.001 )。②免疫组织化学和激光共聚焦显微镜观察结果显示,对照组大鼠动脉组织有微量的JNK和p-c-Jun阳性信号。与对照组比较,络气虚滞状态下JNK和c-Jun的表达明显减少,大鼠动脉组织细胞内JNK和p-c-Jun阳性信号减弱;JNK阳性信号位于大鼠动脉组织细胞胞浆,p-c-Jun阳性信号位于大鼠动脉组织细胞胞核。三种通络方药组JNK和p-c-Jun表达增强。JNK和p-c-Jun阳性信号主要分布在内皮细胞和动脉平滑肌细胞,而且大部分JNK和p-c-Jun阳性信号位于同一细胞。以上结果提示,络气虚滞型血管内皮功能障碍COHb含量显著下降,HO-1mRNA和蛋白表达下调,同时JNK和c-Jun mRNA及JNK和磷酸化c-Jun蛋白水平均显著降低,提示络气虚滞型血管内皮功能障碍HO1/CO系统被抑制。通络方药细胞保护作用的发挥可能与其改善JNK/ c-Jun通路的活性有关,而且JNK激活后,主要通过磷酸化的c-Jun发挥作用。4络气虚滞动物模型血清诱导ECV-304细胞中JNK/c -Jun/HO-1表达的变化及通络方药的干预作用本部分采用络气虚滞组动物模型血清孵育人脐静脉内皮细胞ECV-304,探讨络气虚滞模型血清对JNK/c-Jun通路的影响及其在通络方药上调内皮细胞HO-1表达中的作用,并应用三种通络方药进行干预。实验分为:①对照组:加入对照组大鼠血清;②模型血清组:加入相同浓度络气虚滞动物模型血清;③模型血清+人参组:加入人参孵育,2h后加入相同浓度的络气虚滞动物模型血清;④模型血清+双参组:加入双参孵育,2h后加入相同浓度的络气虚滞动物模型血清;⑤模型血清+通心络组:加入通心络孵育,2h后加入相同浓度的络气虚滞动物模型血清;⑥模型血清+SP600125(JNK特异性拮抗剂)组:于无血清1640培养基中加入SP600125, 2h后加入相同浓度的络气虚滞动物模型血清;⑦人参+SP600125+模型血清组:加入人参,6h后加入SP600125, 2h后加入络气虚滞动物模型血清;⑧双参+SP600125+模型血清组:先于无血清1640培养基中加入双参,6h后加入SP600125, 2h后加入络气虚滞动物模型血清;⑨通心络+SP600125+模型血清组:先于无血清1640培养基中加入通心络,6h后加入SP600125, 2h后加入络气虚滞动物模型血清。各组分别继续培养12h、24h、48h,应用试剂盒测定各组细胞乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)释放率并检测细胞培养上清中CO的含量;RT-PCR、westernblot技术检测各组细胞HO-1、JNK、c-Jun mRNA及其蛋白表达的变化与c-Jun的蛋白磷酸化情况。结果:①与对照组比较,模型血清干预组、sp600125组LDH漏出率于48h明显升高(P<0.05),前者COHb含量于48h明显升高(P<0.05)。与模型血清干预组比较,通心络干预组LDH的释放率于48h显著减少(P<0.01),COHb含量明显升高(P<0.05)。与模型血清+sp600125比较,模型血清+sp600125+双参与模型血清+sp600125+通心络组COHb含量于48h明显升高(P<0.05);②RT-PCR检测结果显示,与对照组比较,模型血清干预组JNK、c-Jun、HO-1 mRNA在不同时间点表达明显升高(P<0.05,P<0.001)。与模型血清干预组比较,三种通络方药可在不同时间点且不同程度上上调JNK、c-Jun、HO-1mRNA的表达(P<0.05,P<0.01,P<0.001),通心络组优于双参和人参组(P<0.001,P<0.05,P<0.01)。与模型血清+sp600125比较,模型血清+sp600125+双参与模型血清+sp600125+通心络组JNK、c-Jun mRNA的表达于24h、48h显著升高P<0.05,P<0.001)。③westernblot检测显示,与对照组比较,模型血清干预组JNK、c-Jun、P-c-Jun、HO-1蛋白于各个时间点均在不同程度上表达升高(P<0.05,P<0.01,P<0.001)。与模型血清干预组比较,三种通络方药均可不同程度上上调JNK、c-Jun、P-c-Jun、HO-1蛋白表达,且通心络优于双参和人参组(P<0.001,P<0.05,P<0.01)。与模型血清+sp600125比较,模型血清+sp600125+通心络组在各个时间点上JNK、c-Jun、P-c-Jun、HO-1蛋白表达均明显升高(P<0.05,P<0.01,P<0.001),这与上述对于基因表达调控的影响相一致。以络气虚滞血管内皮功能障碍动物模型血清干预体外培养人脐静脉内皮细胞,建立细胞损伤模型,进一步从细胞水平上证实了络气虚滞动物模型血清所引起的HO-1/CO系统被抑制与JNK/c-Jun信号转导通路相关。通络方药上调HO-1表达、促进CO释放与JNK/c-Jun信号转导通路有关。结论本实验建立了络气虚滞型内皮功能障碍病证结合动物模型,应用生物信息学方法探讨了络气虚滞型血管内皮功能障碍与NEI网络相关的病理生理学基础及可能的信号转导机制,并探讨了不同类别通络方药干预机制,为运用通络方药防治心脑血管病提供实验依据。1.本研究以近年来社会心理因素对人体造成的超负荷压力在各种急性心脑血管病发生中的影响为立题背景,以络气虚滞型血管内皮功能障碍临床证候诊断标准为依据,首先采用高蛋氨酸饮食诱发高同型半胱氨酸血症建立血管内皮功能障碍模型,以“基础进食+强迫负重游泳”法诱发气虚证候,并以人参、双参、通心络超微粉三种通络药物进行干预,建立络气虚滞病证结合动物模型,观察并记录实验动物的证候学表现、检测血管内皮功能及血管内皮依赖性舒张反应的变化。实验结果显示,所建动物模型表现出了明显的络气虚滞证候特征,同时血管内皮功能及内皮依赖性舒张反应显著下降,三个层次的通络干预可使上述病、证得到不同程度的改善,而且与“脉络—血管系统病”络气虚滞型血管内皮功能障碍的临床证候诊断标准基本吻合,表明模型成功。2.实验结果提示,HCY组血管内皮功能受损,AngII明显升高,但络气虚滞型内皮功能障碍与HCY组比较,AngII升高更为明显,差异显著,显示络气虚滞是AngII上升的重要因素。同时看到,肾素、醛固酮下降,RAAS系统并未激活,而NE与AngII呈现出同步升高的密切关系,提示交感神经兴奋可能是AngII升高的主要原因,这反映“过劳伤气”所致植物神经功能失调可能在血管病变中起着重要作用。而NEI网络调节功能出现了严重紊乱,主要表现为下丘脑机能偏亢,受其调节的垂体功能反而低下,同时该功能轴靶腺肾上腺皮质功能也表现出低下,提示NEI网络的稳态失衡可能与络气虚滞型血管内皮功能障碍发生发展具有密切关系。3.生物信息学的研究结果表明,络气虚滞组NEI网络指标和内皮功能障碍指标之间可以形成相互独立的子系统(如:ET与CRH、ACTH、GC及ALD; AngⅡ与ET、IL-1;PGI2与ALD; NO与ALD分别是4个相互独立的系统),这些子系统是按照复杂系统最优化原则发生相互联系,而正常对照组、HCY组、通络干预组不存在这种子系统之间的相互联系,提示过劳伤气是导致NEI网络紊乱的主要因素,络气虚滞型血管内皮功能障碍可能与NEI网络稳态失衡存在着密切相关性,后者可能是该状态下血管内皮功能障碍发生、发展的病理生理学基础之一。2005年本课题启动时经中国医学科学院医学信息研究所查询MEDLINE(1966.1～2005.6)、PubMed(2005.1～2005.6)、中国生物医学文献数据库(1978.1～2005.4)、中文生物医学期刊文献数据库(2005.1～2005.6)文献,仅有神经、内分泌、免疫分系统与血管病变相互关系的文献报道,未见NEI网络调节功能失常对血管病变影响的报道。尽管本研究仅部分揭示NEI网络功能失调对血管内皮功能障碍的影响,但由于NEI网络作为多维立体调控网络在保持人体稳态机制中的重要作用,深入探讨其对血管病变影响及其内在规律需要引起重视。4.整体动物模型研究发现,络气虚滞型血管内皮功能障碍COHb含量显著下降,HO-1mRNA和蛋白表达下调,同时JNK和c-Jun mRNA及JNK和磷酸化c-Jun蛋白水平均显著降低,提示络气虚滞型血管内皮功能障碍HO-1/CO系统被抑制。以络气虚滞血管内皮功能障碍动物模型血清干预体外培养人脐静脉内皮细胞,建立细胞损伤模型,进一步从细胞水平上证实了络气虚滞动物模型所引起的HO-1/CO系统被抑制与JNK/c-Jun信号转导通路相关。5.整体及细胞水平的研究结果显示,通络方药可明显升高NO,降低ET,改善血管内皮超微结构,同时可降低CRH、AngII及IL-6等水平,升高血浆肾素、醛固酮及糖皮质激素等水平,基于生物信息学分析结果,络气虚滞型血管内皮功能障碍动物模型NEI网络指标与血管内皮功能障碍指标之间具有密切联系,上述结果显示,通络方药不仅可直接改善血管内皮功能,而且还可通过调节NEI网络发挥改善内皮功能的作用,其机制可能与通络方药升高COHb,上调HO-1表达以及与其相关的JNK/c-Jun信号通路的活性有关。