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第一部分EGFL7在NSCLC中的表达及其与临床多药耐药的关系目的研究非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中表皮生长因子样结构域7(epidermal growth factor-like protein 7,EGFL7)和多药耐药基因1/P-糖蛋白(MDR1/P-glycoprotein,MDR1/P-gp)的表达,并结合临床病理资料分析和探讨其相互关系。方法93位NSCLC患者分为手术切除组、化疗组,另收集正常人外周血作为健康对照组。ELISA法检测各组治疗前后外周血中分泌型EGFL7的表达情况。免疫组化法检测手术切除组肿瘤标本中EGFL7和P-gp的表达情况。半定量PCR及荧光定量PCR法检测化疗组化疗前后外周血中EGFL7 m RNA和MDR1 m RNA的表达情况。Spearman相关性检验分析EGFL7与P-gp之间的相关性及与临床病理特征之间的关系。结果ELISA结果得出:NSCLC患者外周血中分泌型EGFL7的表达量显著高于健康对照组;手术切除组患者外周血EGFL7表达量明显低于化疗组;手术切除组患者手术后一周外周血EGFL7表达量显著低于手术前;化疗组患者行含铂方案化疗后外周血中EGFL7表达量明显高于化疗前。免疫组化结果得出:NSCLC组织中EGFL7和P-gp蛋白的表达明显高于相应的癌旁组织,二者具有显著相关性,进一步得出EGFL7和P-gp表达与NSCLC患者性别、年龄无关,而与NSCLC患者的TNM分期有关。PCR结果得出:NSCLC患者化疗后外周血EGFL7 m RNA和MDR1 m RNA的阳性表达率及表达量都明显高于化疗前,其两者之间存在正相关。结论NSCLC患者循环血与肿瘤组织中存在EGFL7高表达,且化疗后表达量进一步升高,其表达与MDR1成正相关,EGFL7可能参与NSCLC化疗多药耐药。第二部分EGFL7与NSCLC缺氧性多药耐药间的关系目的体外实验进一步研究EGFL7与NSCLC细胞多药耐药之间的关系。方法应用体外顺铂连续诱导NSCLC细胞培养NSCLC多药耐药细胞株;CCK-8法和Annexin V-PE/7-AAD染色法检测缺氧培养下NSCLC亲本敏感株(PC9、SPCA1、A549)和多药耐药株(A549/CDDP)对化疗药物的敏感性;Western blot法检测缺氧培养条件下EGFL7和P-gp蛋白的表达情况并探讨两者之间的关系。LVEGFL7与LV-EGFL7-si RNA分别感染NSCLC亲本敏感株和多药耐药株,检测其对化疗药物的敏感性以及P-gp蛋白的表达情况。结果成功建立2ug/ml NSCLC顺铂耐药细胞株A549/CDDP,并进一步鉴定得出其不仅对顺铂而且对卡铂、紫杉醇和吉西他滨同样具有交叉耐药性;CCK-8结果得出:缺氧培养能显著降低NSCLC亲本及耐药细胞株对多种化疗药物的敏感性;Annexin V-PE/7-AAD染色法后流式细胞仪检测结果进一步证实:缺氧能够明显降低NSCLC细胞的化疗敏感性,促使细胞产生多药耐药。Western blot结果得出:缺氧能明显增加EGFL7和P-gp蛋白的表达,并在缺氧培养四小时达到表达高峰;同时A549/CDDP细胞中EGFL7和P-gp蛋白表达明显高于A549细胞中表达。LV-EGFL7感染A549后EGFL7表达明显升高,随之P-gp蛋白表达亦明显增加,但其化疗敏感性则随之降低;LV-EGFL7-si RNA感染A549/CDDP后EGFL7表达明显降低同时并致P-gp蛋白表达亦显著降低,其化疗敏感性随之增加。结论缺氧诱导NSCLC细胞的多药耐药,使其对多种化疗药物的敏感性显著降低,并能进一步加重其耐药细胞株对化疗药物耐药的恶性循环,其机制可能与NSCLC细胞中EGFL7的表达上调有关。第三部分EGFL7参与NSCLC多药耐药的机制研究目的进一步研究EGFL7参与非小细胞肺癌化疗多药耐药的分子机制。方法应用Rodamine123检测膜蛋白外排功能和Caspase 8,9试剂盒检测LV-EGFL7-si RNA处理对A549/CDDP细胞和LV-EGFL7处理对A549细胞药物外排功能和凋亡途径的影响;Western blot法检测LV-EGFL7-si RNA处理A549/CDDP细胞和LVEGFL7处理A549细胞后凋亡蛋白的变化,以及PI3K/Akt及其下游通路和Ras/Raf/MEK/ERK/ELK-1通路相关信号蛋白的变化。结果过表达EGFL7蛋白的A549细胞内Rhodamine123的外排显著增加并Caspase 9的活性明显降低(未影响Caspase 8的活性)。而干扰后低表达EGFL7蛋白的A549/CDDP细胞内Rhodamine123的外排显著减少且Caspase 9的活性明显升高(未影响Caspase 8的活性);进一步检测凋亡相关蛋白变化得出:过表达EGFL7蛋白的A549细胞中促凋亡蛋白Bax表达显著降低,抗凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1和Survivin表达明显升高;相反,干扰后的低表达EGFL7蛋白的A549/CDDP细胞中促凋亡蛋白Bax表达显著升高,抗凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1和Survivin表达明显降低;深入探讨EGFL7参与调节NSCLC多药耐药的信号通路机制得出:过表达EGFL7蛋白的A549细胞中Akt/p-m TOR/p70S6K1、Akt/GSK-3β/P-gp和Ras/Raf/MEK/ERK/ELK-1信号通路持续激活;相反,LV-EGFL7-si RNA干扰后的A549/CDDP细胞中Akt/pm TOR/p70S6K1、Akt/GSK-3β/P-gp和Ras/Raf/MEK/ERK/ELK-1信号通路受到明显抑制。两种处理情况下对Akt/p-Bad、Akt/p-IKKα信号通路无明显影响。结论EGFL7通过作用于PI3K/Akt和Ras/MAPK信号通路调节非小细胞肺癌细胞膜蛋白和凋亡系统的作用而影响其多药耐药特性,其很有可能成为以后临床预测非小细胞肺癌化疗多药耐药的一个重要分子标志物和治疗其化疗多药耐药的一个新型重要的靶点。第四部分沉默EGFL7逆转NSCLC缺氧性耐药的体内实验研究目的研究针对EGFL7靶点的沉默能否在体内有效逆转NSCLC缺氧性多药耐药。方法应用裸鼠皮下注射的方法建立A549人非小细胞肺癌裸鼠移植瘤模型;裸鼠移植瘤随机分为:荷瘤组,不做任何治疗;CDDP组:只给予CDDP化疗药物治疗;CP组:给予CDDP及PBS治疗;CLG组:给予CDDP及LV-GFP治疗;CLE组:给予CDDP及LV-EGFL7-si RNA治疗。计算瘤体体积,以肿瘤体积变化相对于时间变化绘制生长曲线,第36天处死裸鼠结束,摘除裸鼠NSCLC移植瘤并去除瘤体胞膜外组织并进行称重(W),比较各组瘤体的平均重量,采用福尔马林溶液固定肿瘤组织标本用于H&E染色,并免疫组化检测EGFL7和P-gp蛋白在各组中的表达情况。结果A549人非小细胞肺癌细胞裸鼠皮下注射后8-10天各组裸鼠成瘤率达100%,H&E染色证实为非小细胞肺癌,成功建立人非小细胞肺癌裸鼠移植瘤模型;耐药逆转实验结果得出:相对于其他组,LV-EGFL7-si RNA联合CDDP治疗组第16天到裸鼠处死当天肿瘤生长速度明显变缓,处死后称重得出移植瘤重量明显低于其他各组;进一步免疫组化结果得出:EGFL7、P-gp蛋白在移植瘤组织中表达明显增高,而LV-EGFL7-si RNA治疗后两种蛋白的表达量明显下降。结论NSCLC内部缺氧显著增强EGFL7和P-gp的表达,进而引起其多药耐药,针对EGFL7的体内靶点干扰能明显恢复裸鼠移植瘤的化疗敏感性。EGFL7可以作为预测及治疗NSCLC多药耐药的重要靶点。