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目前，基因Ⅶd亚型新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)是亚洲和非洲很多国家和地区的优势流行基因型。有研究发现，基因Ⅶd亚型NDV与早期的NDV强毒株相比，可以引起家禽免疫器官更严重的损伤，突出表现为组织的广泛性坏死和淋巴细胞减少。即使传统疫苗(LaSota)免疫的鸡群仍有可能感染基因Ⅶd亚型流行毒株并且病毒仍然可以在淋巴组织中造成病理损伤，进而降低鸡群的免疫应答效率。但是，基因Ⅶd亚型NDV严重侵害免疫系统的机制还不明确。本研究首先用不同基因型的四株NDV强毒株体外感染鸡脾淋巴细胞，比较了病毒在脾淋巴细胞中的复制性能、诱导的细胞因子应答和细胞死亡。我们又使用相同的毒株进行体内感染实验，比较了病毒在淋巴组织中引起的病理变化、病毒复制和细胞因子应答。为了全面评价宿主应答的作用，我们选择基因Ⅶd亚型NDV JS5/05和基因Ⅳ型NDV Herts/33感染鸡的脾脏进行表达谱芯片实验。此外，为了确定基因Ⅶd亚型NDV严重损害免疫系统的分子基础，我们在JS5/05和Herts/33骨架之间进行M、F和HN基因的单独或联合互换，构建了一系列的嵌合病毒，并评价了重组病毒的临床致病性、病毒复制与诱导的细胞因子应答。 1.不同基因型NDV强毒株体外感染鸡脾淋巴细胞 本研究用两株基因Ⅶd亚型NDV（JS3/05和JS5/05）、基因Ⅸ型NDV F48E8和基因Ⅳ型NDV Herts/33体外感染鸡的脾淋巴细胞。我们测定了病毒复制、干扰素基因的表达水平和细胞死亡情况。结果表明，JS3/05和JS5/05在感染后6、12和24 h时，诱导的Ⅰ型干扰素应答（IFN-α和IFN-β）水平比F48E8和Herts/33诱导的水平高。JS5/05在感染后6h即可上调IFN-γ的表达水平，JS3/05在感染后24 h内可以持续刺激IFN-γ的表达，但是在检测期内，F48E8和Herts/33均不能使IFN-γ的表达发生变化。此外，在感染后6和24 h，与F48E8和Herts/33相比，JS3/05和JS5/05感染可以显著增加脾细胞细胞质中游离核小体DNA的含量，说明JS3/05和JS5/05可以显著提高细胞凋亡水平。Annexin-Ⅴ和PI双染色实验说明除了细胞凋亡，JS3/05和JS5/05还可以诱导严重的细胞坏死。但是，只有JS5/05显示了高水平的病毒复制。JS3/05在感染早期(6 h)诱导的显著的细胞死亡可能抑制了病毒复制。我们的结果说明，宿主应答的程度可能与基因Ⅶd亚型NDV造成脾脏损伤有关。 2.基因Ⅶd亚型NDV在免疫器官中的致病特性 本研究用两株基因Ⅶd亚型NDV（JS3/05和JS5/05）、基因Ⅸ型NDV F48E8和基因Ⅳ型NDV Herts/33感染SPF鸡，比较了病毒在淋巴组织中的病理变化、病毒复制和细胞因子应答。为了评价宿主应答在NDV的致病性中的作用，我们选择JS5/05和Herts/33感染鸡的脾脏进行差异转录组学试验。我们发现四个毒株对鸡都为致死性，但是JS3/05和JS5/05在脾脏和胸腺中造成的病理学损伤更为严重，表现为组织的广泛性坏死、淋巴细胞大量减少和大量巨噬细胞浸润等;而Herts/33仅引起脾脏萎缩和中度淋巴细胞增生或减少。病毒载量测定显示，JS3/05和JS5/05在淋巴组织中的复制水平显著高于F48E8和Herts/33。基因芯片结果显示，JS5/05和Herts/33诱导的宿主应答在性质上是相似的，在量上是不同的，表现在JS5/05可以上调大量的炎性反应相关基因的表达，且基因的表达水平显著高于Herts/33调控的基因，说明JS5/05诱发了更为强烈的机体炎症反应。细胞因子测定结果显示，JS3/05和JS5/05诱导的IFN-β、IL-1-β和IL-18的表达水平高于F48E8和Herts/33诱导的水平，说明JS3/05和JS5/05在淋巴组织中可以诱导更强的细胞因子应答。我们的结果说明，基因Ⅶd亚型NDV的高效复制及其诱导的过激的炎性反应共同造成了免疫器官中严重的病理损伤。 3.基因Ⅶd亚型NDV严重损害免疫系统的分子基础 本研究利用反向遗传学手段，在基因Ⅶd亚型NDV JS5/05和基因Ⅳ型NDV Herts/33之间进行基因互换，构建了一系列的重组病毒。基因互换方式包括M、F和HN基因的单独互换、F和HN双基因互换以及M、F和HN三基因的同时互换。我们评价了重组病毒在淋巴组织中的临床病理学特性、病毒复制和诱导的细胞因子应答。结果显示，单独互换M、F或HN基因以及互换F和HN双基因都不能使JS5/05和Herts/33在脾脏中的病变发生转换。但是，JS5/05骨架中同时表达Herts/33的M、F和HN基因时，重组病毒造成脾脏坏死的能力消失，病变为脾脏萎缩、无坏死灶，与rHerts/33的病变一致;相应地，Herts/33骨架中同时表达JS5/05的M、F和HN基因时，重组病毒获得了诱导脾脏严重病变的能力，病变表现与rJS5/05的病变一致。这说明M、F和HN基因共同决定了JS5/05严重损害免疫系统的特性。此外，同时互换M、F和HN基因能够使病毒的复制性能和细胞因子表型在JS5/05和Herts/33之间发生较大程度的转换。我们的结果说明，M、F和HN基因共同介导病毒的高效复制和强烈的炎症应答，这三个基因是基因Ⅶd亚型严重损害鸡免疫系统的分子基础。 全文小结 (1)用基因Ⅶd亚型NDV JS3/05和JS5/05、基因Ⅸ型NDV F48E8和基因Ⅳ型NDVHerts/33体外感染鸡的脾淋巴细胞，基因Ⅶd亚型NDV诱导的强烈的干扰素应答和细胞死亡可能与病毒引起的脾脏损伤有关，说明宿主应答在基因Ⅶd亚型NDV致病过程中有重要作用。 (2)动物实验结果说明，上述四个毒株对SPF鸡均为致死性，但是JS3/05和JS5/05在脾脏和胸腺中造成的病理组织损伤比F48E8和Herts/33造成的病变更严重，表现为组织细胞的严重坏死、大量淋巴细胞的减少和炎性细胞浸润。JS3/05和JS5/05在淋巴组织中的高水平复制和引起的强烈的炎性应答是其造成严重病理损伤的基础。 (3)JS5/05和Herts/33之间同时互换M、F和HN基因可以使病毒的病理学特征、病毒复制和细胞因子表型发生较大程度的转换，说明M、F和HN基因共同介导了病毒高效复制和激烈的炎症反应，这三个基因是基因Ⅶd亚型NDV严重侵害免疫系统的分子基础。