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我国盐环境资源丰富,其中蕴藏的丰富嗜盐古菌类群有待发掘。本文采用纯培养技术研究海洋型和非海洋型盐环境中嗜盐古菌多样性,比较不同盐环境中嗜盐古菌类群的差异;挖掘嗜盐古菌基因组中的功能基因,克隆嗜盐古菌胞外蛋白酶编码基因,异源表达、纯化和复性重组蛋白,表征新型嗜盐古菌胞外蛋白酶的酶学性质;希望为耐盐蛋白酶的研究与开发提供科学依据。非海洋型盐环境乌兰忽少海子中的55株嗜盐古菌分属于12个属的17个种,其中Natronococcus属为优势菌属;海洋型盐环境东营盐场中的54株嗜盐古菌分属于8个属的16个种,其中Haloarcula属为优势菌属。两类盐环境均具有丰富且不同的嗜盐古菌类群。多相分类学研究结果表明,两类盐环境的菌株WLHS5~T、WLHSJ27~T和DYF38分别代表一个新属(Natronorussus halophilus gen.nov.,sp.nov.WLHS5~T)和两个新种(Halovivax halophilus sp.nov.WLHSJ27~T、Salinigranum halophilum sp.nov.DYF38)。从分离菌株中筛选到产胞外蛋白酶活性最高的菌株DYF46。从该菌株基因组中得到5条疑似胞外蛋白酶基因,将这5条基因克隆并转化嗜盐古菌Haloferax volcanii H1424,验证得到一条具有较高蛋白酶活性的基因hly,可编码新型嗜盐古菌蛋白酶Hly。Hly具有信号肽、前肽和催化结构域,不含典型嗜盐古菌胞外蛋白酶中普遍存在的C端延伸区(C-terminal extension,CTE)。新型嗜盐古菌胞外蛋白酶Hly可与同类型胞外蛋白酶的CTE实现重组,Hly和中性嗜盐古菌CTE的重组蛋白酶不影响重组蛋白酶的酶活。通过异源表达、柱上复性和凝胶过滤层析获得高活性、高纯度新型嗜盐古菌胞外蛋白酶Hly。Hly对大分子蛋白质底物偶氮酪蛋白和小分子四肽底物Suc-AAPF-pNA均具有很高的催化活性。Hly虽然分离自极端嗜盐古菌,却在低盐环境下具有很高酶活,最适为0.5 M NaCl,在高盐条件下也具有很好的稳定性。Hly在广泛温度范围30-60℃下均具有较高酶活,最适为45℃。Hly更适应碱性环境,最适pH为8.5/9。Hly可耐受多种金属离子、有机试剂和洗涤剂。丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF使Hly几乎失活,表明其为丝氨酸蛋白酶。综上所述,本研究从乌兰忽少海子和东营盐场中分离到了丰富的嗜盐古菌类群,完成了3株嗜盐古菌的多相分类研究,得到了一种新型且性状优良的嗜盐古菌胞外蛋白酶Hly,为进一步将其应用于食品工业奠定了基础。