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口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth disease Virus,FMDV)引起猪、牛和羊等偶蹄动物感染的一种重大烈性传染病,是《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020)》中的三个单列病种之一。目前,灭活疫苗的免疫接种是预防、控制和净化口蹄疫的主要手段。但口蹄疫病毒对热极其敏感(尤其是O型口蹄疫病毒),温度升高容易诱导病毒粒子解离成五聚体亚单位(12S)而导致疫苗的有效抗原(146S)含量降低,从而影响疫苗的免疫保护效力,进而影响口蹄疫的有效防控。因此,面对目前的市场需求,急需发展一种耐热特性优良的口蹄疫鉴别诊断疫苗,有效提升我国口蹄疫疫苗质量,满足国家口蹄疫免疫净化防控的技术需求。为了发展热稳定的口蹄疫鉴别诊断疫苗候选毒株,本论文从以下3部分进行研究:1.以实验室构建的免疫原性优良的O型口蹄疫标记病毒感染性克隆pO/TAA为骨架,在结构蛋白引入单个或多个氨基酸突变,分别构建了10种基因修饰的口蹄疫全长重组质粒。全长质粒经Not I线化后分别转染表达T7 RNA聚合酶的BSR/T7细胞,共成功拯救了9株重组病毒。对重组病毒进行RT-PCR测序和间接免疫荧光鉴定,结果证明拯救的6株口蹄疫重组病毒(rvO/EN、rvO/ER、rvO/FH、rvO/FI、rvO/FN、rvO/FO)含预期的氨基酸突变。2.在不同温度和pH=6.0条件下对重组病毒进行热和酸解离实验,结果表明三株重组病毒(rvO/EN、rvO/FN、rvO/FO)的热和酸稳定性明显优于亲本病毒。重组病毒的一步生长曲线、噬斑特性分析结果显示在结构蛋白引入不同的氨基酸突变会不同程度的影响病毒的复制能力和噬斑表型。遗传稳定性分析结果表明,重组病毒在BHK-21细胞上连续传8代,一个重组病毒(rvO/EN)引入的氨基酸发生了部分的回复,另五个病毒中引入的氨基酸稳定存在。3.选取三株热稳定性优良的重组病毒制备灭活疫苗免疫猪,每隔一周采血制备血清,用病毒中和实验分析结构蛋白氨基酸的突变对病毒抗原性的影响。结果表明,S2093H、Y2098F和S2093H-Y2098F的突变不会影响病毒的免疫原性。