根据全球癌症统计数据表明,结直肠癌（CRC）已经是第三大常见恶性肿瘤,每年约有超过90多万人死于CRC,死亡率位居世界第二,是和肿瘤有关的死亡的主要原因,同时也是美国第二大常见死亡原因。目前CRC的治疗手段仍主要以手术切除为主,随着治疗手段的不断进步,虽然CRC 5年生存率有所提高,但术后复发及远处转移依然是CRC病人死亡的主要原因。肿瘤侵袭和转移与上皮间充质转化（EMT）密切相关,已被认为是引起CRC转移的主要原因。EMT过程非常复杂,总的来说是上皮细胞通过改变自身的形态结构、迁移以及粘附的能力,然后通过EMT获得间充质,浸润周围组织从而转移到远处。寻找参与EMT进程的分子靶点对于改善CRC患者预后具有重要意义。环状RNA（circRNA）是一类普遍存在的内源性非编码RNA,与线性RNA相比,circRNA缺少5’端帽子结构和3’端poly A尾,能够抵抗核酸外切酶的水解作用,因而其在细胞中的稳定性较高。早期发现的circRNA被认为是被错误剪切的产物,但是随着科技的发展以及高通量测序技术的出现,人们通过研究发现circRNA在某些疾病的发生发展过程中扮演着重要的作用,参与了很多疾病的基因调控过程。虽然已有研究证实circRNA具有miRNA的结合位点,可以作为miRNA的分子海绵竞争性结合miRNA,调节下游靶基因,参与转录调节,以及与RNA结合蛋白的相互作用,调控circRNA在细胞内的表达水平,可以促进或抑制肿瘤细胞的迁移、增殖和侵袭,抑制或促进凋亡。但是仍有许多的circRNAs的功能不清楚。Sirtuins（SIRT）是哺乳动物NAD+依赖性组蛋白脱乙酰基酶,SIRT1是Sirtuin家族的成员,是酵母sir2（沉默信息调节剂2）蛋白的人类直系同源物,它参与细胞的能量代谢、增殖衰老、炎性反应、神经保护、肿瘤形成等多个过程。已有报道证实SIRT1在食管癌、CRC、乳腺癌中与肿瘤增殖、转移和侵袭有关。最近的一项研究表明circ-sirt1在动脉粥样硬化和新生内膜形成中起重要作用。但是来源于SIRT1宿主基因的circRNA在CRC中的功能和机制尚不清楚。本研究通过以下三部分探讨了circ-SIRT1在CRC中的表达、功能及作用机制。第一部分circ-SIRT1在结直肠癌组织和细胞株中的表达目的:通过检测CRC组织和细胞株（HCT116、HT29）与配对癌旁组织和人结肠粘膜正常上皮细胞株（FHC）中circ-SIRT1的表达水平,分析circ-SIRT1的表达是否存在差异,以及与临床特征之间是否存在关系。方法:1、设计并委托生物公司化学合成circ-SIRT1的扩增引物;2、提取CRC组织、HCT116、HT29细胞株中与配对癌旁组织、FHC细胞株中的RNA,通过反转录、qRT-PCR等方法检测circ-SIRT1的表达是否存在差异;3、通过统计学分析circ-SIRT1差异表达与临床特征之间的关系。结果:使用qRT-PCR方法证实circ-SIRT1在CRC组织和细胞株中的表达,之后检测于我院外二科收集的通过病理诊断为腺癌的52例CRC组织以及距离癌组织＞10cm以上配对的癌旁组织,结果显示,与癌旁正常组织相比,circ-SIRT1在CRC组织中的表达显著上调（P＜0.05）,检测HCT116、HT29及FHC细胞株中circ-SIRT1表达发现,与FHC细胞株相比,circ-SIRT1在HCT116、HT29细胞株中呈高表达,这个结果与在CRC组织中的结果一致。通过统计分析临床样本所对应的患者信息发现,circ-SIRT1表达的上调与肿瘤侵袭深度呈正相关（P＜0.05）,而与患者的年龄、性别、肿瘤的大小、肿瘤位置、TNM分期、淋巴结转移等无明显关系（P＞0.05）。结论:circ-SIRT1在CRC组织和细胞中表达上调,且与肿瘤侵袭深度呈正相关。第二部分circ-SIRT1的表达对结直肠癌细胞生物学功能及EMT的影响目的:探究circ-SIRT1低表达对CRC细胞株HCT116、HT29的生物学行为及EMT相关蛋白的表达的影响,探究敲低circ-SIRT1是否影响SIRT1 mRNA的表达。方法:1、委托生物公司设计并化学合成si-RNA;2、使用qRT-PCR方法检测si-RNA的敲低效率;3、qRT-PCR检测敲低circ-SIRT1后SIRT1 mRNA表达水平的变化;4、划痕实验检测迁移能力、CCK-8实验检测细胞增殖活力、平板克隆实验检测克隆形成能力、Transwell实验检测细胞侵袭能力,应用以上实验方法检测敲低circ-SIRT1后对细胞迁移、增殖、侵袭能力的影响;5、应用Western Blot方法检测EMT相关蛋白的表达。结果:使用qRT-PCR检测发现si-RNA的敲低效率具有统计学意义（P＜0.05）,且以si-circ-SIRT#2效率最高（P＜0.01）。同时,敲低circ-SIRT1不影响SIRT1 mRNA的表达水平（P＞0.05）。CRC细胞功能实验研究表明,敲低circ-SIRT1后CRC细胞的迁移能力、细胞增殖活力、克隆形成能力及侵袭能力均受到显著抑制（P＜0.05）。Western Blot结果表明,敲低circ-SIRT1下调了N-钙粘蛋白和波形蛋白的表达,上调了E-钙粘蛋白的表达（P＜0.05）。结论:敲低circ-SIRT1抑制了CRC细胞迁移、增殖及侵袭能力,下调了N-钙粘蛋白和波形蛋白的表达,上调了E-钙粘蛋白的表达且不影响SIRT1 mRNA表达水平。第三部分circ-SIRT1通过结合eIF4A3促进结直肠癌EMT的机制目的:探究circ-SIRT1促进增殖、侵袭及EMT的分子机制。方法:1、使用Circ Interactome预测与circ-SIRT1结合的蛋白;2、应用RIP和RNA pull-down实验进行验证;3、检测敲低circ-SIRT1后对其结合蛋白表达的影响;4、应用RIP实验检测circ-SIRT1过表达后EMT mRNA区域结合蛋白的丰度;5、Western Blot检测敲低结合蛋白（si-BRPs）后对EMT相关蛋白表达的影响;6、Western Blot检测si-circ-SIRT1#2和si-BRPs共转染后EMT相关蛋白的表达变化。结果:Circ Interactome预测结果表明EIF4A3是circ-SIRT1结合位点最多的蛋白,应用RIP和RNA Pull-Down实验证实了circ-SIRT1与EIF4A3的结合。Western Blot结果表明敲低circ-SIRT1不影响EIF4A3的表达。circ-SIRT1过表达后,RIP结果表明EIF4A3在N-钙粘蛋白和波形蛋白免疫沉淀区域的丰度减少,但是在E-钙粘蛋白区域没有显著变化。使用si-eIF4A3敲低EIF4A3后上调了N-钙粘蛋白和波形蛋白的表达,E-钙粘蛋白没有显著变化。分别使用si-circ-SIRT1#2或/和si-eIF4A3转染HCT116细胞后发现,si-circ-SIRT1#2对N-钙粘蛋白和波形蛋白的抑制被同时转染si-eIF4A3所逆转,对E-钙粘蛋白没有影响。结论:circ-SIRT1可以与EIF4A3相结合,并且EIF4A3不受circ-SIRT1表达变化的影响,过表达circ-SIRT1降低了EIF4A3在EMT mRNA区域的丰度,促进了EMT。