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目的 采用细胞培养的技术体外培养四种卵巢癌细胞株,观察其生长特点、镜下形态及分裂增殖能力差别。并分别收集四种卵巢癌细胞采用免疫细胞化学和RT-PCR的方法检测各株细胞中67kDa层粘连蛋白受体(67kDa LN-R)的表达情况,确定67kDa LN-R表达阳性的细胞株,为进一步研究其在卵巢癌侵袭转移机制中的作用奠定理论基础。 方法 复苏冻存卵巢癌细胞株HRA、SKOV3、3AO、OVCAR3,分别培养于加入10%新生牛血清、1×10~5 IU/L青霉素、100 mg/L链霉素的RPMI 1640培养液中,在37℃、5%二氧化碳培养箱中培养并传代至对数生长期。根据四种细胞分裂增殖情况绘制生长曲线,并利用Giemsa染色观察比较四种细胞形态差别。将四种细胞分别制成细胞飞片,采用免疫细胞化学的方法检测67kDa LN-R蛋白表达情况,分别收取10~6个卵巢癌细胞,运用RT-PCR半定量的方法检测各株细胞mRNA水平67kDa LN-R的表达情况,以确定67kDa LN-R阳性表达细胞株。 结果 免疫细胞化学检测卵巢癌细胞67kDa LN-R蛋白表达结果:SABC法所显示的LN-R阳性表达为棕黄色染色,HRA、SKOV3、3AO卵巢癌细胞的细胞膜及细胞浆均见明显棕黄色颗粒表达,而OVCAR3卵巢癌细胞未见阳性染色。RT-PCR检测结果示HRA、SKOV3均可见明显的约为474bp的67kDa LN-R的特异性条带,3AO细胞特异性条带较弱,而OVCAR3为阴性表达。 结论 卵巢癌细胞HRA、SKOV3的67kDa层粘连蛋白受体mRNA及蛋白水卵巢癌细胞;细胞培养;67kDa层粘连蛋白受体;表达山东人学博十学位论文巢癌细胞HRA24至48小时内部分细胞变圆,细胞内出现毒性颗粒,并出现凋亡小体。更换培养液后48至72小时细胞生长状况恢复。MTT检测活细胞比率及流式细胞术凋亡检测结果示转染后细胞增殖均受到抑制。免疫细胞化学、流式细胞仪法显示转染67kDa LN-R ASODN与对照组相比,HRA细胞67kDa LN一R蛋白表达明显减弱;半定量RT-PCR法结果显示转染ASODN后HRA 67kDa LN一R的mRNA表达亦明显降低。Transwell小室检测转染0.02 ug/ ul、0.04 ug/ ul、0.08 ug/ul层粘连蛋白受体反义寡核普酸组与对照组相比对细胞的侵袭力依次降低,且不同剂量之间的差别也有显著性(P<0.05)。免疫细胞化学检测转染ASODN后卵巢癌细胞HRA随反义核酸浓度的增加MMP一2表达逐渐降低,而转染ASODN后SKOV3卵巢癌细胞KAn肿瘤抑制基因的表达呈现递增趋势。 结论本实验所设计的67kDa LN一 R ASODN能有效的抑制卵巢癌细胞HRA67kDa层粘连蛋白受体的蛋白表达和基因表达,并明显抑制了卵巢癌细胞体外侵袭转移能力,且出现剂量依赖性。67kDa LN--R ASODN能影响卵巢癌细胞肿瘤转移相关因子MMP一2和KAll的表达。 关键词反义寡核昔酸;凋亡;侵袭力;转染;基质金属蛋白酶一2; KAn/C D82