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一氧化氮(nitric oxide,NO)在胃肠道内广泛分布,参与调节胃肠道的许多生理和病理过程,如黏膜保护、血流量的调节、黏液的分泌和胃肠动力的调节。内源性NO是以左旋精氨酸(L—arginine)为底物,还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(还原型辅酶Ⅱ)(reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate,NADPH)为辅酶,在一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)作用下催化产生,NOS有3种同工酶,即神经型NOS(neuronal NOS,nNOS)、内皮型NOS(endothelialNOS,eNOS)和诱导型NOS(inducible NOS,iNOS)。 近年来的研究显示内源性一氧化碳(carbon monoxide,CO)也是一种重要的气体信使分子,在机体内类似于NO,能自由地通过各种生物细胞膜,通过可溶性鸟苷酸环化酶-环磷酸鸟苷(sGC-cGMP)途径发挥生物学效应。机体内源性CO的主要来源于血红素的分解代谢。血红素氧合酶(heme oxygenase,HO)在NADPH和细胞色素P-450还原酶及分子氧作用下,催化血红素降解为胆绿素和CO。HO有三种同工异构酶,诱导型HO(inducible HO,HO-1)、结构型HO(constitution HO,HO-2)和功能尚不十分清楚的HO-3。HO-1是一种热休克蛋白(HSP30),对引起氧化应激和其它病理条件的所有刺激或化合物十分敏感。 肠神经系统(enteric nervous system,ENS)是胃肠道神经元在胃肠道内聚集在一起形成相对独立的神经网络,由肌间神经丛和黏膜下神经丛所组成,并由兴奋性神经元、抑制性神经元、中间神经元及有关递质按一定规律组成局部反射回路,支配从食道中段起到肛门止的整个消化道,调控胃肠道的运动、水和电解质分泌、微循环活动和激素的释放,还参与胃肠免疫反应和炎症过程的调节。ENS虽然也受CNS调控,但可独立进行信息传递及程序处理,协调肠道的整体行为,被喻为浙江大学研究生硕士学位论文 “肠脑”(brain一in一the一到t)。 19世纪以来,人们己认识到胃肠道神经系统在控制胃肠道活动中的重要性。正常情况下肠道神经递质通过神经免疫内分泌网络与胃肠激素、细胞因子等相互调控,使胃肠道功能处于动态的平衡中。近年来的研究发现,肠道疾患的发病机制与中枢神经系统和肠神经丛功能失调密切相关,可引起肠运动功能紊乱。ENS及其邻近结构功能障碍构成了消化道疾病的主要病理生理学基础。 肠易激综合征(I币table bowel syndrome,IBs)是二一种以腹痛或腹部不适及大便习惯改变为特征的慢性功能性肠道病变。现已公认ms是一种感觉动力紊乱性疾病,以对机械性或化学性刺激的高敏感性(即高反应性或易激性)为特征。溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)是一种反复发作的肠道慢性非特异性炎症和溃疡性病变,虽然取得了很大的研究进展,但其病因和发病机制至今还不完全清楚。 在疾病的发生和发展过程中,信息分子可能影响信号转导途径,引起神经内分泌免疫网络调节失衡。CO和NO除了具有调节血流和平滑肌的张力等作用外,还参与信息的传递。我们推测CO和NO可能参与了肠道中信息的传递,肠道功能失调可能源于CO和NO信息传导的紊乱。 研究表明胃肠道病症与NOS加O代谢失衡有关,然而NO的细胞来源还没有确定。最近的研究发现HO一1在动物胃肠道有保护作用,但是在人胃肠道的分布还未见相关报道。关于HO一1和 iNOS在胃肠道的相互.作用还不清楚。 本研究的目的:(1) HO一1和iNOS在人肠道疾病中结肠的分布与代谢变化,提供CO和NO作为肠道信使的证据。(2)采用纸带束缚应激(wraP一restraint stress,WRS)模拟的IBS模型和醋酸(Aeetic aeid,A。)诱导的UC模型,检测HO一l和在iNOS在大鼠结肠组织中的分布与代谢变化。(3)应用HO一1特异性抑制剂锌原叶琳一9(ZnPp9)和iNOS抑制剂左旋硝基精氨酸甲酷(I.一NAME),以佐证Ho/CO和iNOSfNO在胃肠道中的作用,探讨HO和iNOS在胃肠道中的作用。(4)分析HO一l和iNOS在肠道表达的异同和相关性,探讨气体信使分子CO和NO在肠道信息传递中的相互作用及它们在肠道疾患发病机制中病理生理学意义。 材料与方法1.病例选择和实验动物1.1病例选择:34例符合罗马H标准、连续就诊的发作期IBS患者。33例符合2000浙江人学研究生硕_卜学位论文年成都全国炎症性肠病学术研讨会”制定的《溃疡性结肠炎诊断标准》的UC患者,另设16例为正常对照组。1,2实验动物:选用健康雄性SD大鼠,体重200一2209,由浙江省实验动物中心提供,实验前所有的动物在实验室饲养3天。大鼠分成4组:模型组(n=12)、锌原叶琳(ZnPP)+模型组(n二12)、左旋硝基精氨酸甲醋(L一NAME)+模型组(n=12)和及正常对照组(n=10)2.动物实验2.1束缚一制动应激的大鼠IBS模型采用纸带束缚限制大鼠上身和前肢的运动,制作IBS动物模型,纸带束缚时间为lh。对照组不束缚;2.2醋酸诱导的大鼠UC模型采用6%Ac灌肠方法制作UC动物模型。对照组用生理盐水代替6%Ac灌肠。2.3药物在实验前3小时颈后皮下注射znMP(45umol瓜g)或者L一NAME(20m留kg)3.组织标本收集与处理3.1经结肠镜检取IBS和UC患者降结肠勤膜。对照组相同部位取材。3.2动物实验结束后迅速处死动物,剖腹取距肛门7cm处的结肠,纵形剖开,用生理盐水漂洗后,观察结肠标本形态变化。3.3所有标本按常规进行