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玉米赤霉烯酮（ZEA）和脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）是环境中常见的霉菌毒素且通常共同污染食物或饲料。ZEA和DON均具有免疫毒性,但人们至今并没有完全搞清它们尤其是两者联合作用下所导致的免疫毒性及相关机制。针对不同类型病原,机体会产生不同的免疫效应。单增李斯特菌（Listeriamonocytogenes）作为常见的食源性致病菌之一,其感染主要发生在细胞内,细胞免疫是机体抵御并清除这种病原菌入侵的关键。这其中涉及了 T细胞的活化以及Th1亚型的分化过程。本研究通过建立小鼠ZEA、DON及其联合中毒+L.monocytogenes感染模型以及体外诱导经毒素暴露后的Naive CD4T细胞发生活化及向Th1亚型分化,使用流式细胞术、western blot、细胞因子芯片,蛋白质组学等技术,检测细菌感染及体外诱导后Naive CD4T细胞活化及分化相关免疫指标的变化。探讨了ZEA、DON及其联合对抗胞内菌感染后Th1细胞介导的细胞免疫的影响及机制。本研究可以为深入揭示这两种霉菌毒素的免疫毒性及其分子机制提供新的理论依据。1.ZEA、DON及其联合对L.monocytogenes感染小鼠脾脏损伤及炎症的影响C57BL/6 小鼠经 ZEA（10 mg/kg）,DON（1 mg/kg）及其联合（ZEA+DON,10 mg/kg+1 mg/kg）连续灌胃7d后,于第8d通过尾静脉注射接种L.monocytogenes（5×104 CFU）。感染持续7d,并在期间保持毒素连续灌胃。模型建立后,进行以下试验:①通过流式细胞术检测细菌感染第3、5、7 d脾脏中单核细胞比例,以反映L.monocytogenes感染效应;②观测小鼠每日摄食量及体重变化并用涂布法检测细菌感染第3、5、7 d脾脏细菌载量;③HE染色观察脾脏病理损伤;④流式细胞术检测脾脏巨噬细胞M1、M2型极化作用;⑤细胞因子芯片检测感染第5d血清中IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-12等40种炎症细胞因子的分泌水平。结果显示,①L.monocytogenes感染期间,脾脏中单核细胞比例显著上升（p＜0.01）,DON导致感染各时期单核细胞比例均显著下降（p＜0.01）;ZEA和ZEA+DON-导致单核细胞比例在感染第7 d发生显著下降（p＜0.05）。②Listeria组小鼠在感染第3 d体重开始下降。ZEA、DON及其联合不同程度地加快小鼠体重在感染前后的损失。ZEA导致脾脏细菌载量在感染第3 d和第5 d显著上升（p＜0.01）;DON和联合组导致脾脏细菌载量在感染第3、5、7 d均显著上升（p＜0.01）。与单独毒素组相比,联合毒素组在感染第3d和第5d引起的细菌载量上升效应呈类似协同作用。③ZEA、DON及其联合在细菌感染期间加重小鼠脾脏多种病理变化如髓外造血、多核巨细胞增多、淋巴细胞坏死以及结缔组织增生等,且毒素联合组最为严重。④毒素导致感染各时期巨噬细胞比例均发生下降;ZEA组M1巨噬细胞的极化作用在感染第5 d发生显著下降（p＜0.05）;DON组M1巨噬细胞极化作用在感染各时期均发生显著下降（p＜0.01）;毒素联合组M1巨噬细胞极化作用在感染第3 d和第5 d发生显著下降（p＜0.05或p＜0.01）。联合毒素组中巨噬细胞的M1极化作用没有出现类似协同性下降。⑤与空白对照组相比,Listeria组鉴定出RANTES和MIG差异性上调。与Listeria组相比,ZEA处理后鉴定出TIMP-1差异性上调以及FasL和IL-1β差异性下调;DON处理后鉴定出上调的KC、BLC、Eotaxin-2、TIMP-1和MIG以及下调的IL-1β、IL-12p40/p70、LIX和FasL;毒素联合处理后鉴定出上调的BLC、TIMP-1和MIG以及下调的IL-12p40/p70。所有毒素组的差异蛋白均显著富集在细胞免疫反应、炎症和细胞趋化性等作用。以上结果表明,ZEA、DON及其联合可抑制L.monocytogenes感染后正常的炎症反应并加重细菌导致的脾脏损伤。2.ZEA、DON及其联合对L.monocytogenes感染后小鼠CD4 T细胞活化及Th1亚型分化的影响为了进一步研究ZEA、DON及其联合对L.monocytogenes-感染后小鼠Th1介导的细胞免疫的影响,对感染各时期内相关免疫指标进行了流式细胞术检测。①CD4 T细胞活化标示分子CD69、CD25、CD71的表达;②CD4 T细胞共刺激分子CD28、CD152的表达;③CD4 T细胞CD62L的耗竭作用以及CD44的表达;④CD4 T细胞IL-12受体的表达;⑤IFN-γ分泌型T细胞分化情况。结果显示,①DON组CD4 T细胞中CD69的表达在感染第3 d显著下降（p＜0.01）;毒素组中CD25的表达均无显著变化;联合毒素导致感染第7 d CD4T细胞中CD71的表达显著下降（p＜0.05）。②DON导致CD4T细胞中CD28与CD152的比值显著下降（p＜0.05）。③DON导致CD4 T细胞上CD62L的表达在感染第5 d时显著下降（p＜0.01）,随后在感染第7d时又发生显著上升（p＜0.01）;毒素联合导致CD62L的表达在感染第7 d显著上升（p＜0.01）。ZEA导致CD44在CD4+CD62L-细胞中的表达在感染第3 d发生显著下降（p＜0.01）;DON导致CD44的表达在感染各时期均发生显著下降（p＜0:05或p＜0.01）;毒素联合导致CD44的表达在感染第3 d和第5 d逐渐显著下降（p＜0.05或p＜0.01）。④毒素单独及联合均导致CD4 T细胞IL-12受体的表达发生下降（p＜0.05或p＜0.01）。⑤毒素联合、ZEA以及DON分别在感染第3、5、7d导致CD4+IFN-γ+（Th1）分化效应的显著降低（p＜0.05）;ZEA在感染第5 d和第7 d导致了显著的CD8+IFN-γ+分化效应降低（p＜0.05）。在本研究中,毒素联合组几乎没有观察到类似协同作用。以上结果表明,ZEA、DON及其联合可以抑制L.monocytogenes感染后小鼠CD4 T细胞正常的活化效应以及向Th1亚型分化效应。3.ZEA、DON及其联合对L.monocytogenes感染后小鼠脾脏蛋白质组的影响为了阐明在ZEA、DON及其联合的影响下对机体感染L.monocytogenes后蛋白质组的整体变化以及对细菌感染后机体生命活动分子网络的影响。选择感染第7d小鼠脾脏,通过基于非标记定量方法（Label-free）的蛋白质组学鉴定并筛选感染组与毒素+感染组中差异表达的蛋白质,并对差异蛋白质进行包括GO注释、KEGG注释以及COG注释分析,最终对核糖体功能相关差异蛋白进行Western bolt验证。结果显示,与Listeria组相比,ZEA处理组鉴定出125个差异表达蛋白,其中上调89个,下调36个;DON处理组鉴定出136个差异表达蛋白,其中上调48个,下调88个;毒素联合处理组鉴定出556个差异表达蛋白,其中上调323个,下调233个。差异蛋白GO注释在ZEA、DON及其联合处理下的BP本体中高度富集在包括细胞过程、代谢过程、生物调控、定位和多细胞生物体过程;在CC本体中高度富集在细胞、细胞部分、细胞器、细胞外区域和膜封闭腔;在MF本体中高度富集在结合活性、催化活性和转运体活性。相比于Listeria组,ZEA导致的差异蛋白主要参与了核糖体功能（35.19%）以及代谢通路（14.81%）;下调的差异蛋白主要参与了代谢通路（12%）以及传染性疾病如疟疾（32%）和阿米巴原虫（8%）的发生。DON导致的差异蛋白主要参与了核糖体功能（29.33%）、代谢通路（10.67%）以及剪接体功能（10.67%）;下调的差异蛋白主要参与了代谢通路（22.86%）、造血细胞谱系（17.14%）等。ZEA+DON导致的上调的差异蛋白主要参与了代谢通路（17.53%）以及核糖体功能（14.34%）;下调的差异蛋白主要参与了代谢通路（30.05%）以及造血细胞谱系（10.93%）等。三种差异表达的核糖体亚基（RPL13、RPL24和RPS24）在所有毒素处理中均被鉴定出,western印迹进行验证结果与组学结果一致,与Listeria组相比,除了 RPS24在毒素联合组上升不显著外,三种蛋白的表达量在所有毒素处理组中均不同程度地显著上升（p＜0.05或p＜0.01）。以上结果表明,ZEA、DON及其联合可以对L.monocytogenes感染后小鼠蛋白质表达造成不同程度的影响,其中对核糖体通路的影响主要体现在过度激活核糖体蛋白,从而有助于细菌在胞内的繁殖。4.ZEA、DON及其联合对体外Naive CD4T细胞活化及Th1亚型分化的影响及机制为了验证体内实验取得的结论并探究其具体机制,本研究通过免疫磁珠提取得到高纯度小鼠脾脏Naive CD4T细胞,对其进行不同浓度ZEA、DON及其联合暴露的同时,利用Anti CD3+Anti CD28双信号刺激抗体+Th1亚型细胞分化刺激抗体Anti IL-4+重组细胞因子IL-2和IL-12对细胞进行体外诱导活化及分化。之后对相关免疫指标进行检测。在对细胞活化过程中的研究显示:毒素单独及联合组中细胞活性在48小时和72小时不同程度地显著下降（p＜0.05或p＜0.01）。不同浓度的毒素组均可以不同程度地抑制淋巴细胞转化效应,表现在细胞分散、聚团能力减弱,并伴有细胞裂解等现象;与阳性对照组比较,DON（1 μmol/L）组、ZEA（10 μmol/L）+DON（1 μmol/L）组以及 ZEA（20 μmol/L）+DON（0.5 μmol/L）组中 CD25出现显著下降（p＜0.01）;除ZEA（10 μmol/L）组以外,其余毒素处理组CD71均出现显著下降（p＜0.01）。相比于毒素单独组,毒素联合组ZEA（20 μmol/L）+DON（0.5 μmol/L）对CD25及CD71的影响出现显著的协同作用（p＜0.01）;与阳性对照相比,除ZEA（10μmol/L）组外,其余毒素处理组中CD28/CD152比例均显著下降（p＜0.01）。DON（0.5 μmol/L）和ZEA+DON（20+0.5 μmol/L）导致 LAT 和 Zap-70 显著下降（p＜0.01）;ZEA+DON（20+0.5 μmol/L）同样导致Zap-70 磷酸化水平的显著下降（p＜0.05）;ZEA（20 μmol/L）、DON（0.5μmol/L）以及ZEA+DON（20+0.5 μmol/L）均可导致Lck磷酸化水平的下降。相比于单独毒素组,毒素联合组仅在p-Lck表达抑制中观察到类似协同作用;所有毒素处理组均显著抑制Ki-67的表达水平（p＜0.01）。在对细胞分化过程中的研究显示,与Anti CD3+Anti CD2＆阳性对照组相比,毒素处理组中 ZEA（10,20 μmol/L）、DON（1 μmol/L）、ZEA+DON（10+1μmol/L）以及ZEA+DON（20+0.5 μmol/L）均显著抑制IL-12受体表达水平（p＜0.05或p＜0.01）。相比于单独毒素组,毒素联合组中仅ZEA+DON（10+1μmol/L）组观察到类似协同作用（p＜0.01）;此外,所有毒素处理组均显著抑制T-bet的表达水平（p＜0.01）。相比于单独毒素组,毒素联合组中没有观察到类似协同作用;利用western blot检测细胞诱导4d后TCR信号通路蛋白如PI3K、Akt、PDK1、mTOR表达及其磷酸化水平。与阳性对照组相比,除了ZEA（10μmol/L）对PI3K的表达无显著影响外,所有毒素组中均观察到对所有蛋白表达的显著抑制作用（p＜0.05或p＜0.01）。与阳性对照组相比,所有毒素处理组均显著抑制CD4+IFN-γ+（Th1）亚型细胞的分化水平（p＜0.01）。最后,所有毒素处理组均显著抑制Th1亚型特异性细胞因子IFN-γ以及TNF-α的分泌水平（p＜0.01）。相比于单独毒素组,TNF-α的分泌水平在ZEA+DON（10+1 μmol/L）组观察到类似协同抑制作用（p＜0.01）。以上结果表明,ZEA、DON及其联合通过抑制TCR信号通路的激活,进而影响Naive CD4 T细胞的活化效应以及向Th1亚型分化效应,最终阻碍Th1亚型细胞相关免疫功能的执行。综上所述,ZEA、DON及其联合暴露可影抗体酶先天性免疫介导的炎症反应,抑制Th1细胞介导的细胞免疫效应,从而加重了L.monocytogenes对小鼠的感染。其机制为ZEA、DON及其联合暴露抑制了 Naive CD4 T细胞经TCR调控的活化及分化信号的传导。说明ZEA、DON导致的免疫毒性作用可体现在对特异性免疫细胞活化及分化的抑制作用上。