目的动脉粥样硬化是一种严重危害人类健康的血管慢性炎症性病变。随着对动脉粥样硬化发病机制研究的不断深入,越来越多的证据表明固有免疫和适应性免疫均参与了该疾病的发生和发展。近年来的结果显示,补体系统在动脉粥样硬化的发展中发挥了重要的作用。补体系统是机体固有免疫反应中重要的一部分,有三条不同的活化通路(经典通路、MBL通路和替代通路),分别通过不同的机制活化C3和C5转化酶,最终形成攻膜复合体(membrane attack complex, MAC), MAC可在靶细胞上形成贯通细胞膜的通道,最终导致靶细胞的裂解。研究显示MAC除了具有裂解细胞的效应外,还有亚裂解作用,即,当细胞膜表面形成的MAC浓度较低而不足以裂解细胞的时候,可以活化细胞内一系列的信号通路诱导细胞释放炎性介质,影响内皮细胞和平滑肌细胞的功能,参与炎症反应和血栓形成等过程。机体为了保护自身细胞免受补体攻击,存在着多种补体调节蛋白,它们分别在不同阶段调节补体的活化,其中C3、C5转化酶及MAC是重要的调节节点。CD59是一种重要的膜结合型补体调节蛋白,主要功能是抑制MAC形成(图1)。本课题组及其他学者发现,在高脂饲料诱导的小鼠动脉粥样硬化模型中,CD59的缺失可以促进斑块的发展,而过表达人的CD59可以减缓斑块发展,进一步发现CD59是通过抑制MAC的形成减缓了高脂诱导的动脉粥样硬化的发展。我们知道,除了高血脂,高血糖是引发动脉粥样硬化的另一重要诱因,糖尿病患者的动脉粥样硬化发病率明显高于非糖尿病患者。那么,CD59是否对高血糖(如糖尿病)诱导的动脉粥样硬化也有作用呢?研究CD59在高血糖诱导的动脉粥样硬化中的作用,对糖尿病大血管并发症的防治有重要价值。Crry是小鼠中与人补体调节分子DAF、MCP的同源蛋白,具有DAF和MCP同样的作用,可以抑制三条补体活化途径中C3转化酶的活性(图1)。体外重组蛋白CR2-Crry是在Crry基础上改良得到的靶向补体抑制剂,这种靶向作用是通过将Crry与补体受体2(CR2)相连接来实现的。一般来说,CR2的配体有iC3b、C3dg和C3d,这些都是补体活化过程中C3被催化裂解后产生的细胞膜结合产物,是补体活化区域的标志物。通过这种方式,CR2可以将与之连接的补体调节分子Crry带往机体内补体活化的区域,从而发挥Crry的抑制补体活化的功能。这种利用补体调节分子靶向调控补体活化以治疗疾病的方法正在被广泛研究。研究发现,CR2-Crry可以通过靶向抑制病灶局部补体活化而缓解小鼠缺血再灌注、肠炎等多种疾病引发的损伤,但对于同样有补体活化的动脉粥样硬化,CR2-Crry是否有治疗作用尚不清楚,抑制斑块局部补体的活化能否成为动脉粥样硬化的治疗手段也需要进一步研究。因此,为了进一步研究补体负调节分子在动脉粥样硬化的防治中的可能作用,本课题在前期发现CD59具有抑制高脂诱导动脉粥样硬化的基础上,进一步在动物模型中探讨了其在糖尿病诱导的动脉粥样硬化中的作用；并通过CR2介导的靶向作用,研究了Crry对高脂诱导动脉粥样硬化的治疗效应；继而进一步探讨了补体促进动脉粥样硬化发展的机制。研究结果对揭示补体在动脉粥样硬化中的作用和机制有重要的理论价值,对利用靶向抑制补体活化来治疗动脉粥样硬化提供了实验依据。本论文包括三部分：一、补体调节分子CD59在糖尿病诱导的动脉粥样硬化中的作用；二、靶向补体抑制剂CR2-Crry在动脉粥样硬化中的治疗作用；三、补体活化终产物攻膜复合体MAC促进动脉粥样硬化形成的可能机制。方法一、 CD59在糖尿病诱导的动脉粥样硬化中的作用(一)链脲霉素(Streptozotocin, STZ)诱导的糖尿病动脉粥样硬化小鼠模型的建立1.随机选取8周龄mCd59ab-/-/Apoe-/-(n=12)和Apoe-/小鼠(n=7)作为STZ处理组,腹腔注射的方法给予100mg/kg的STZ,每周注射两次,共注射两周,作为糖尿病组。2.随机选取8周龄mCd59ab-/-/Apoe-/-(n=5)和Apoe-/小鼠(n=5)作为PBS对照组,按照同样方法腹腔注射PBS,作为非糖尿病组。3.STZ或PBS注射后,所有小鼠常规饲料喂养16个周,每周测量小鼠血糖变化,STZ处理组中从第三个周开始平均血糖浓度高于200mg/dl的认为是高血糖小鼠。(二)检测CD59缺失对STZ诱导的糖尿病动脉粥样硬化的影响1.取小鼠主动脉,将血管内壁暴露,用0.4%油红O溶液染色,分析主动脉大体斑块面积2.取小鼠主动脉根部,制备连续冰冻切片,HE染色和油红0染色检测斑块的结构和脂质沉积情况；免疫荧光染色检测斑块局部MAC的活化情况,以及巨噬细胞的浸润。同时检测小鼠血液中胆固醇和甘油三酯的变化。二、靶向性补体抑制剂CR2-Crry对动脉粥样硬化的治疗作用(一) CR2-Crry的制备及生物素标记1. CR2-Crry的真核细胞表达及纯化：CR2-Crry表达质粒通过电转仪转入小鼠NSO细胞,收集细胞,通过亲和柱吸附获得CR2-Crry,用PH2.7的甘氨酸溶液洗脱蛋白质,并收集到1MTris盐酸中,浓缩透析后,取部分样品进行SDS-PAGE电泳,确定浓度及纯度。2. CR2-Crry的生物素标记：使用EZ-Link Sulfo-NHS-Biotinylation试剂盒进行CR2-Crry生物素标记,通过生物素结合试验确定生物素化程度。(二) CR2-Crry在动脉粥样硬化斑块局部的靶向性12周龄Apoe-/-小鼠随机分为三组,分别尾静脉注射1)生物素标记的CR2-Crry0.25mg/只,作为实验组(n=3)；2)含等量游离生物素的PBS,作为对照组(n=3)；3)未标记的CR2-Crry(1mg/只)和生物素标记的CR2-Crry (0.25mg/只],作为竞争结合组(n=2)。每周两次,共一个月,同时给予小鼠高脂饲料喂养。一个月后,处死小鼠,取主动脉根部制备连续冰冻切片,免疫组织化学染色观察生物素沉积情况。(三) CR2-Crry干预治疗对动脉粥样硬化的影响1. Apoe-/小鼠中CR2-Crry干预治疗：6周龄Apoe-/小鼠随机分为两组,尾静脉注射给予实验组小鼠(n=7)0.25mg/只的CR2-Crry,同时给予对照组小鼠(n=6)同样体积的PBS,每周两次,同时维持小鼠高脂饲料喂养16周。2. mCd59ab-/-/Apoe-/小鼠中CR2-Crry干预治疗：6周龄mCd59ab-/-/Apoe-/小鼠随机分为两组,尾静脉注射给予实验组小鼠(n=6)0.25mg/只的CR2-Crry,同时给予对照组小鼠(n=6)同样体积的PBS,每周两次,同时维持小鼠高脂饲料喂养8周。3. CR2-Crry处理对小鼠动脉粥样硬化发展的影响(1)取小鼠主动脉,将血管内壁暴露,用0.4%油红0溶液染色,分析主动脉大体斑块面积。(2)取小鼠主动脉根部,制备连续冰冻切片,HE染色和油红0染色检测斑块的结构和脂质沉积情况；免疫荧光染色检测斑块局部C3和MAC的沉积情况,以及巨噬细胞和T细胞的浸润。(3)检测小鼠体重、血液中胆固醇和甘油三酯的变化。三、攻膜复合体促进动脉粥样硬化的机制研究(一)亚裂解浓度的MAC对巨噬细胞泡沫化的影响1.确定MAC对巨噬细胞的亚裂解浓度；取小鼠巨噬细胞系RAW264.7,体外给予不同浓度的C5b6(200;100;50;25;12.5;6.75ug/ml),以及固定浓度的C7、C8、C9(25ug/ml)。台盼蓝染色计算细胞死亡率,将细胞死亡率小于5%时的C5b6浓度记为亚裂解浓度,同时流式分析该浓度下细胞表面C9沉积情况。2.亚裂解MAC对LDL和ox-LDL诱导的巨噬细胞泡沫化的影响(1)取RAW264.7巨噬细胞,加入LDL或ox-LDL预刺激2小时,然后分别加入1)C5b6(25,12.5ug/ml), C7, C8, C9(25ug/ml);2) C5b6(25,12.5ug/ml);3) C7, C8,C9(25ug/ml)。方法同上,37℃培养24或48小时后,油红0染色观察脂质吞噬情况,然后通过异丙醇抽提油红0染料进行定量。(2)取mCd59ab-/-和野生型小鼠腹腔巨噬细胞,加入ox-LDL预刺激2小时,然后加入同样浓度的MAC,即C5b6, C7, C8, C9(10ug/ml),37℃培养24小时,观察泡沫细胞形成情况,方法同上。3.亚裂解MAC对巨噬细胞ox-LDL摄取以及胆固醇逆转运相关基因的表达影响；取RAW264.7细胞,加入C5b6及C5b6,7,8,9(MAC)刺激,24小时后收取RNA, qRT-PCR检测CD36, SR-A1, SR-B1, LOX-1, ABCA1, ABCG1, PPARγ, LXRα的表达。(二)亚裂解浓度的MAC对巨噬细胞和内皮细胞炎性细胞因子和生长因子表达的影响取巨噬细胞RAW264.7和内皮细胞C166,加入C5b6及C5b6,7,8,9(MAC)刺激,24小时后收取RNA, qRT-PCR检测IL-1β, IL-6, MCP-1, TNF-α, bFGF,, PDGF和VEGF的表达。结果一、CD59在糖尿病诱导的动脉粥样硬化中的作用(一)STZ诱导的糖尿病动脉粥样硬化小鼠模型的建立临床和动物实验结果提示,补体系统在糖尿病诱导的大血管及微血管并发症中发挥重要作用,我们之前的研究也发现,在高脂饲料诱导的小鼠动脉粥样硬化模型中,CD59可以通过抑制MAC减缓高脂诱导的动脉粥样硬化的发展,这都提示我们补体可能参与了糖尿病诱导的大血管并发症即动脉粥样硬化。为了在动物模型中研究CD59在糖尿病诱导的动脉粥样硬化中的作用,我们使用STZ在mCd59ab-/-/Apoe-/-和Apoe-/小鼠中诱导糖尿病动脉粥样硬化模型,并比较CD59缺失对斑块发展的影响。两种小鼠分别给予100mg/kg的STZ,处理后第三周开始,两种小鼠体内血糖浓度均开始升高,超过200mg/dl并随着时间持续升高,说明该模型建立成功,并且CD59的缺失对小鼠血糖浓度和体重没有明显影响。(二)CD59的缺失促进了糖尿病诱导的动脉粥样硬化的发展STZ成功诱导了糖尿病小鼠模型,常规饲料喂养16周后,取小鼠主动脉,主动脉大体油红O染色发现,STZ处理的mCd59ab-/-/Apoe-/-和Apoe-/-小鼠主动脉均有严重的动脉粥样硬化斑块。相比于Apoe-/-小鼠,mCd59ab-/-/Apoe-/-小鼠的主动脉具有更加严重的斑块。主动脉根部HE染色和油红O染色显示,mCd59ab-/-/Apoe-/小鼠斑块面积、脂质含量也明显大于Apoe-/-小鼠。两种小鼠之间胆固醇和甘油三酯的含量没有明显差别。同时,PBS处理的mCd59ab-/-/Apoe-/-与Apoe-/-小鼠无论主动脉大体还是根部斑块面积均明显小于STZ组,且两种小鼠之间无明显区别。这些结果说明,CD59的缺失加快了糖尿病诱导的动脉粥样硬化,并且不依赖于血糖、血脂浓度的变化,这提示我们补体参与到了糖尿病的大血管并发症。进一步,斑块局部免疫荧光染色发现,mCd59ab-/-/Apoe-/-小鼠斑块局部MAC的沉积明显增强,巨噬细胞的比例也明显升高。该部分结果说明,MAC参与到了CD59缺失促进的糖尿病动脉粥样硬化,并且影响了斑块局部巨噬细胞的浸润。二、靶向性补体抑制剂CR2-Crry可以缓解小鼠动脉粥样硬化的发展(一)CR2-Crry在动脉粥样硬化斑块局部的定位新近发现的靶向补体抑制剂CR2-Crry,可以通过CR2特异性的靶向至补体活化区域并通过Crry抑制补体的活化。我们首先验证了CR2-Crry对动脉粥样硬化斑块局部的靶向性。我们选用目前广泛使用的动脉粥样硬化模型Apoe-/-小鼠,随机分为三组,分别尾静脉注射1)生物素标记的CR2-Crry,作为实验组(n=3)；2)含等量游离生物素的PBS,作为对照组(n=3)；3)生物素标记的CR2-Crry和4倍量未标记的CR2-Crry,作为竞争组(n=2)。高脂饲料喂养一个月后处死小鼠,免疫组织化学染色观察生物素在斑块局部沉积情况发现,在CR2-Crry实验组小鼠的斑块局部细胞表面可以观察到生物素阳性染色,在含有过量未标记CR2-Crry的竞争组中生物素阳性染色明显减弱,而对照组中生物素染色为阴性。这说明,在粥样硬化斑块形成的早期,斑块部位即存在补体的活化,且靶向性的补体抑制剂CR2-Crry可以作用于斑块局部的补体活化部位。(二) CR2-Crry可以减缓动脉粥样硬化的发展。1. CR2-Crry可以减小Apoe-/-小鼠斑块面积及脂质含量为了进一步研究靶向性抑制补体活化对动脉粥样硬化是否具有治疗作用,我们使用CR2-Crry干预Apoe-/-小鼠,每周两次,共四个月,并维持高脂饲料喂养。主动脉大体油红O染色结果显示CR2-Crry能够明显抑制斑块的形成,主动脉根部的HE染色也显示斑块面积明显减少。此外,小鼠体重、血清中胆固醇和甘油三酯含量没有明显区别。以上结果说明,CR2-Crry可能通过抑制斑块部位补体活化减缓Apoe-/-小鼠动脉粥样硬化的发展,并且对全身的脂质代谢没有影响。2. CR2-Crry可以减小mCd59ab-/-/Apoe-/小鼠斑块面积及脂质含量接下来,我们用mCd59ab-/-/Apoe-/-小鼠对CR2-Crry治疗动脉粥样硬化的作用进行了进一步验证。前期的研究发现在Apoe-/-小鼠中,抑制MAC形成的调控蛋白CD59a和CD59b缺失可以加速动脉粥样硬化的发展,且斑块部位有更多的补体活化终产物MAC沉积,说明MAC具有促进动脉粥样硬化的作用。因此我们使用CR2-Crry对mCd59ab-/-/Apoe-/-小鼠中因MAC过度形成而加速的动脉粥样硬化进行治疗,结果发现,相对于PBS处理,CR2-Crry能够明显减小mCd59ab-/-/Apoe-/-小鼠主动脉及主动脉根部斑块面积。此外,小鼠体重、血清中胆固醇和甘油三酯含量没有明显区别。这提示我们,在补体过度活化而加剧的动脉粥样硬化中,CR2-Crry也可以通过抑制补体活化拮抗加速的斑块发展。综上所述,靶向性抑制补体活化可以减缓Apoe-/和mCd59ab-/-/Apoe-l-小鼠动脉粥样硬化的发展,并且对小鼠的脂质代谢没有影响。3. CR2-Crry抑制斑块局部补体活化及炎性细胞浸润为了进一步确认CR2-Crry的抗动脉粥样硬化作用与靶向抑制斑块局部C3活化和MAC形成有关,我们对小鼠主动脉根部切片进行免疫荧光染色。结果表明,CR2-Crry可以明显减弱Apoe-/-和mCd59ab-/-/Apoe-/-小鼠斑块局部C3和MAC的活化。此外,CR2-Crry处理可以降低斑块局部巨噬细胞和T细胞的比例。上述结果证明了补体活化和MAC积累可以促进动脉粥样硬化发生,而靶向性抑制补体活化对动脉粥样硬化具有治疗作用。三、攻膜复合体(MAC)促进动脉粥样硬化的机制研究(一)亚裂解浓度的MAC促进巨噬细胞泡沫化巨噬细胞吞噬过量脂质形成泡沫细胞是动脉粥样硬化的主要特征。之前研究发现,CD59缺失后,过度活化的MAC可以促进高血脂诱导以及高血糖诱导的动脉粥样硬化的发展。同时,外源性Crry可以通过抑制补体活化而治疗动脉粥样硬化,这都提示补体活化终产物MAC在动脉粥样硬化发展中的核心作用,为了进一步研究其具体机制,我们首先研究了MAC在体外对巨噬细胞泡沫化的影响。1.确定体外实验中MAC的亚裂解浓度研究表明,MAC在斑块局部主要以较低浓度的亚裂解形式发挥作用,而非高浓度的直接裂解靶细胞。为了确定合适的亚裂解浓度,我们在细胞培养体系中顺序加入MAC不同蛋白组分：C5b6、C7、C8、C9,使C9在细胞表面多聚化,形成MAC。其中,单独的C5b6不能形成完整的复合体,只有在依次加入C7,C8和C9后,才能形成MAC。结果显示,当加入25ug/ml的C5b6、C7、C8和C9时,细胞死亡率小于5%,但高于单独的C5b6,我们选用该浓度作为MAC的亚裂解浓度,进行后续实验。流式分析结果显示,在该亚裂解浓度下,细胞表面有C9沉积。2.亚裂解浓度的MAC促进ox-LDL诱导的巨噬细胞泡沫化接下来我们在体外研究了亚裂解浓度的MAC(C5b6,C7,C8,C9)对ox-LDL诱导的巨噬细胞RAW264.7泡沫化的影响。油红0染色和异丙醇定量发现,相对于空白对照和C5b6对照,MAC(C5b6,C7,C8,C9)可以明显提高RAW264.7对ox-LDL的吞噬作用,并且具有浓度依赖性和时间依赖性。此外,在相同浓度的MAC刺激下,mCd59-/-小鼠腹腔巨噬细胞泡沫化明显强于野生型小鼠。这些结果说明,亚裂解浓度的MAC在体外可以促进ox-LDL诱导的泡沫细胞的形成。3.亚裂解浓度的MAC不影响LDL诱导的巨噬细胞泡沫化目前研究认为,斑块局部巨噬细胞在形成泡沫细胞时,除了通过清道夫受体吞噬ox-LDL,还可以通过非受体介导的胞饮作用直接吞噬原始状态的LDL。前一部分发现MAC可以增强ox-LDL诱导的巨噬细胞泡沫化,为了研究MAC对胞饮作用介导的LDL吞噬的影响,我们使用同样的亚裂解浓度的MAC (C5b6,C7,C8,C9)刺激RAW264.7,同时加入500ug/ml的原始LDL,48小时后进行油红O染色及异丙醇定量发现,MAC (C5b6,C7,C8,C9)对RAW264.7吞噬LDL没有影响。结合前一部分,这说明MAC对胞饮作用介导的LDL的吞噬没有影响,只特异性的影响清道夫受体介导的ox-LDL的吞噬。4.亚裂解浓度的MAC可能通过上调清道夫受体CD36表达,抑制脂质转运分子ABCA1,ABCG1的表达而促进巨噬细胞泡沫化CD36、SR-A1、SR-B1和LOX-1是介导巨噬细胞吞噬ox-LDL的清道夫受体,而ABCA1和ABCG1负责将细胞内过量的脂质以游离胆固醇的形式排出。我们发现,相对于C5b6单独刺激,MAC (C5b6,C7,C8,C9)可以上调CD36的表达,而其它清道夫受体的表达没有明显变化。同时MAC还可以下调ABCA1和ABCG1的表达,这说明MAC通过促进CD36介导的吞噬,抑制ABCA1和ABCG1介导的排出,促进了ox-LDL诱导的泡沫细胞的形成。此外我们还发现,MAC对细胞内LXRα和PPAγ的表达没有影响,由于ABCA1、ABCG1和CD36分别受到XRs和PPARγ的转录调控,这部分结果提示我们,MAC对ABCA1、ABCG1和CD36的表达调控可能不依赖于LXRs和PPARr。综上,MAC通过上调清道夫受体CD36以及下调ATP结合盒转运体ABCA1和ABCG1,促进巨噬细胞对ox-LDL的吞噬。(二)亚裂解浓度的MAC促进巨噬细胞及内皮细胞中炎性细胞因子和生长因子的表达炎性细胞因子和生长因子是促进斑块发展的重要因素,为了研究MAC对炎性细胞因子及生长因子表达的影响,我们在体外利用MAC (C5b6,C7,C8,C9)处理巨噬细胞RAW264.7和内皮细胞C166,24小时后qRT-PCR检测相关基因mRNA水平变化。结果发现,MAC刺激可以显著增强RAW264.7和C166中MCP-1, IL-6, IL-1β和TNF-α等炎性细胞因子和bFGF, PDGF和VEGF等生长因子的表达。这部分结果说明,MAC可以在转录水平促进炎性细胞因子及生长因子的表达,为MAC的促动脉粥样硬化作用提供了可能的机制。结论1.补体调节分子CD59在糖尿病诱导的动脉粥样硬化中的作用我们首次在小鼠模型中发现,补体调节分子CD59的缺失可以加快糖尿病诱导的动脉粥样硬化的发展,,伴随着斑块局部MAC沉积和巨噬细胞浸润的增多。这提示MAC可以促进糖尿病诱导的动脉粥样硬化。2.靶向性补体抑制剂CR2-Crry可以缓解动脉粥样硬化的发展CR2-Crry可以靶向抑制斑块局部补体C3活化和MAC的形成,并有效抑制巨噬细胞和T细胞的浸润,减小Apoe-/-小鼠的斑块面积。同时还可以抑制mCd59ab-/-/Apoe-/-小鼠中因MAC过度活化而加剧的斑块发展。本研究证明了将靶向性的补体抑制用以治疗动脉粥样硬化发生和发展的可行性。3.亚裂解浓度的MAC可以促进泡沫细胞的形成和炎性细胞因子、生长因子的表达亚裂解MAC可以通过促进清道夫受体CD36的表达,抑制脂质转运体ABCG1和ABCA1的表达,加速ox-LDL诱导的巨噬细胞泡沫化。此外我们发现,MAC可以在转录水平上促进巨噬细胞和内皮细胞中炎性细胞因子和生长因子的表达。创新性及意义本研究中我们通过体内体外实验研究了固有免疫重要的一部分,补体系统在动脉粥样硬化中的作用,对进一步了解补体系统在心血管疾病发生发展中的作用以及利用补体抑制剂对其治疗的可行性,提供了重要的理论价值和潜在的应用价值。本研究的主要创新点及意义如下：1.利用MAC抑制分子CD59缺失小鼠,首次在小鼠模型中证明,CD59的缺失可以促进糖尿病诱导的动脉粥样硬化,提示MAC参与了高血糖诱导的大血管并发症,为进一步研究CD59糖基化失活与糖尿病并发症的关系提供了有利的依据。2.首次证实靶向补体抑制剂CR2-Crry可以靶向至动脉粥样硬化斑块局部,抑制补体活化进而抑制斑块发展,证明了靶向性抑制斑块补体活化用来治疗动脉粥样硬化的可行性。3.本实验发现亚裂解浓度的MAC可以通过影响清道夫受体CD36和ATP盒转运体ABCA1和ABCG1的表达,加速ox-LDL诱导的泡沫细胞的形成,同时发现MAC可以促进炎性细胞因子和生长因子的表达。为补体和MAC促进动脉粥样硬化提供了具体机制,研究的局限性1.未进一步研究其他更加特异的靶向性补体抑制剂,如局部抑制MAC形成的CR2-CD59,作用于旁路途径的CR2-factor H,以及特异性的CR2-DAF。同时,没有进一步研究靶向补体抑制在糖尿病诱导的动脉粥样硬化中的作用。这都将帮助了解在斑块局部,MAC是如何活化的,并且进一步证实将靶向性抑制补体活性作为未来治疗动脉粥样硬化有效手段的可行性。2.MAC促进泡沫细胞形成的分子机制需要进一步研究。