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本文采用成年健康本地山羊72只,平均体重9.99±1.23kg,随机分为6组,每组12只,即内毒素处理组(LPS组,1mg/kg)、褪黑素保护组(MT+LPS组)、褪黑素对照组(1mg/kg组)、氨基胍保护组(AG+LPS组)、氨基胍对照组(AG组,25mg/kg)和生理盐水对照组(SL组)。每组分别在药物处理后第3h和第6h,随机取6只羊,犬眠宝麻醉(0.8ml/只),剖腹取肝,匀浆,蔗糖密度梯度差速离心法提取肝线粒体,考马斯亮蓝法测定线粒体蛋白含量。应用紫外分光光度法检测肝线粒体中超氧化物岐化酶(T-SOD)、丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽还原酶(GR)和总抗氧化能力(T-AOC)的水平,以及线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ五个复合体的活性;应用JC-1染色结合流式细胞仪和荧光分光光度仪检测肝线粒体膜电位(△ψm)变化;应用高效液相色谱.电化学(HPLC-ECD)检测肝线粒体DNA (mtDNA) 中 8-羟基-脱氧鸟嘌呤核苷 (8-OH-dG)含量;应用NAO染色结合荧光分光光度仪检测线粒体膜特异组分.心磷脂(CL)含量的变化;并且研究了内毒素在体外对山羊肝线粒体膜电位的影响及褪黑素和氨基胍干预作用。旨在探讨内毒素血症山羊肝线粒体功能的变化以及褪黑素和氨基胍对其影响。
1.内毒素血症时,LPS组第3h和第6h山羊肝线粒体抗氧化酶T-SOD、CAT、GSH-Px、GR活性降低,T-AOC活力显著降低(P<0.05),MDA含量显著增加(P<0.05),提示LPS诱导氧自由基大量生成,使肝线粒体脂质过氧化作用增强。与LPS组比,MT+LPS组和AG+LPS组肝线粒体中MDA含量显著减少(P<0.05),抗氧化酶活性明显恢复,T-AOC活力增高(P<0.05)。表明褪黑素和氨基胍能通过提高肝线粒体抗氧化能力,清除多余自由基,来抑制LPS诱导肝线粒体脂质过氧化损伤。
2.内毒素血症时,LPS组第3h和第6h肝线粒体复合体活性明显降低,尤其复合体Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ的活性显著降低(P<0.05);而MT+LPS组和AG+LPS组复合体Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ的活性与LPS组比,显著增高(P<0.05),表明LPS可影响肝线粒体内膜呼吸链的电子传递速率,降低了肝线粒体利用氧的能力;而MT和AG则可能提高复合体Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ的活性,改善内毒素所致的肝线粒体能量代谢障碍。
3.内毒素血症时,LPS组第3h和第6h肝线粒体膜电位均明显低于SL组(P<0.05),MT+LPS组和AG+LPS组肝线粒体膜电位则显著高于LPS组(P<0.05)。与MT+LPS组第3h比,第6h肝线粒体膜电位出现明显降低趋势,二者之间存在显著差异(P<0.05);与AG+LPS组第3h比,第6h肝线粒体膜电位,虽然出现降低趋势,但无显著差异(P>0.05)。
4.内毒素血症时,LPS组mtDNA 中 8-OH-dG 的含量均显著高于其它各组(P<0.05);随着内毒素作用时间延长,LPS组mtDNA中8-OH-dG的含量呈不断增加趋势(P<0.05)。MT+LPS组AG+LPS组和8-OH-dG的含量在第3h和第6h,均显著低于LPS组(P<0.05)。MT+LPS组在第3h处于与SL相近的水平,但随着时间延长,8-OH-dG的含量在增加,第6h时,8-OH-dG 的含量显著高于SL组和第3h(P<0.05);但AG+LPS组在第3h仍明显高于SL组(P<0.05),但在第6h降至与SL组相近的水平。
5.内毒素血症时,LPS组山羊肝线粒体CL含量明显下降,显著低于SL组(P<0.05),并且随着LPS作用时间延长,CL含量仍在继续降低;MT+LPS 组和AG+LPS组CL含量明显回升,LPS组比有显著差异(P<0.05),但MT+LPS组CL水平明显低于SL组(P<0.05),并且在第6h明显低于第3h;而AG+LPS组CL水平与SL组接近,无明显差异(P>0.05),并且在第6h与第3h比,无明显变化。
6.在体外,不同浓度的LPS与含荧光染料JC-1线粒体孵育后,都使JC-1进入肝线粒体的形成聚集体的数量减少,随时间延长,LPS各组整体荧光强度均低于对照组。JC-1 进入肝线粒体的形成聚集体的数量减少,表明线粒体膜电位的降低。其中以0.5g/L LPS作用效果最明显。不同浓度的MT+LPS和AG+LPS都使荧光染料JC-1进入肝线粒体的形成聚集体的数量增加,随时间延长,MT+LPS和 AG+LPS 各组整体荧光强度均高于LPS(0.5g/L)组。JC-1进入肝线粒体的形成聚集体的数量增加,表明线粒体膜电位的升高。其中以MT 0.07 g/L和 AG 20g/L 作用效果最明显。
本实验在国内首次采用直接分离线粒体,应用高特异荧光探针JC-1染色流式细胞仪和荧光分光光度仪同时检测的方法,进行线粒体膜电位研究,并首次将其应用于山羊内毒素血症的研究中,填补了该领域的空白。在国内首次同时探讨了两种抗氧化药物褪黑素和氨基胍在体内外对内毒素血症山羊肝线粒体功能的影响,验证了两种药物抗氧化损伤的作用,为兽医临床内毒素血症的防治提供科学理论依据。