补体系统由一系列血清蛋白和细胞表面受体组成,其在非特异性免疫和特异性免疫之间起着衔接作用,而非特异性免疫和特异性免疫是机体抵御病原入侵和感染的重要防御体系。补体系统可通过经典途径、凝集素途径和旁路途径这3条既相对独立又相互作用的途径激活而发挥作用。黄颡鱼是一种重要的淡水经济鱼类,近些年来,黄颡鱼大面积和高密度养殖逐渐增多,导致黄颡鱼腹水病、体表溃疡病和红头病等病害频发,进而减少黄颡鱼的产量,影响其经济价值。因此,研究黄颡鱼补体相关基因Pf_C8α、Pf_C8β和Pf_C9的分子特征及其在免疫过程中的表达变化,探讨其在非特异性免疫中的潜在功能,对于黄颡鱼的病害防治具有重要意义,同时可为黄颡鱼抗病品种的选育提供基础数据。本研究采用RACE克隆了黄颡鱼补体相关基因Pf_C8α、Pf_C8β和Pf_C9的部分cDNA序列,通过荧光定量PCR(qPCR)检测了Pf_C8α、Pf_C8β和Pf_C9基因在黄颡鱼成鱼各个组织中的表达、在胚胎和早期发育时期的表达量变化以及灭活嗜水气单胞菌免疫前后Pf_C8α、Pf_C8β和Pf_C9基因在脾、中肾、头肾、肝和血液五种免疫组织中的表达量变化。主要研究结果如下:1.黄颡鱼Pf_C8α、Pf_C8β和Pf_C9基因cDNA部分序列的克隆与序列分析黄颡鱼Pf_C8αcDNA部分序列长1939 bp(GenBank登录号KT588317),包括145 bp的3’-UTR和1794 bp的编码区,编码597个氨基酸。同源性比对显示,黄颡鱼Pf_C8α氨基酸序列与斑马鱼(Danio rerio)、鳜(Siniperca chuatsi)和虹鳟(Oncorhynchus mykiss)的同源性较高,分别为54%、52%和51%。黄颡鱼Pf_C8βcDNA部分序列长1767 bp(GenBank登录号KT588318),包括31 bp的5’-UTR、35 bp的3’-UTR和1701 bp的编码区,编码566个氨基酸。同源性比对显示,黄颡鱼Pf_C8β氨基酸序列与斑马鱼、白斑狗鱼(Esox lucius)和虹鳟的同源性分别为62%、61%和60%。黄颡鱼Pf_C9 cDNA部分序列长1939 bp(GenBank登录号KT454382),包括133 bp的3’-UTR和1806 bp的编码区,编码601个氨基酸。同源性比对显示,黄颡鱼Pf_C9氨基酸序列与草鱼(Ctenopharyngodon idella)、虹鳟和条石鲷(Oplegnathus fasciatus)的同源性分别为52%、50%和49%。与其他硬骨鱼类的C8α、C8β和C9氨基酸序列相似,黄颡鱼Pf_C8α、Pf_C8β和Pf_C9氨基酸序列都含有4个不同的功能结构域,分别为TSP 1、LDLR-A、MACPF和EGF结构域。2.黄颡鱼pf_c8α、pf_c8β和pf_c9mrna的组织表达qpcr结果表明,黄颡鱼补体基因pf_c8α、pf_c8β和pf_c9mrna在检测的各个组织中均有表达,且在肝脏中的表达量最高,在头肾、前肠、中肠、后肠、中肾、心脏和脾组织中表达量中等,在其他组织中表达量较低。3.黄颡鱼pf_c8α、pf_c8β和pf_c9mrna在胚胎和早期发育时期的表达黄颡鱼pf_c8αmrna在胚胎和早期发育各个阶段均有表达,从受精卵至神经胚期表达水平较低,发育至心跳期呈现最高表达水平,从血液循环期至刚孵出仔鱼,pf_c8αmrna表达量显著下降至中等水平;孵出后,仔鱼中pf_c8αmrna表达量下降至较低水平。黄颡鱼pf_c8βmrna在胚胎和早期发育各个阶段均有表达,在受精卵中呈现中等表达,从卵裂期至心跳期,pf_c8βmrna表达量显著下降至较低水平,在血液循环期表达量上调至中等水平,在刚孵出仔鱼中呈现最高表达水平;孵出后5d,pf_c8βmrna表达量显著下降到较低水平,孵出后15d~25d,pf_c8βmrna表达量又小幅升高至中等水平。黄颡鱼pf_c9mrna在胚胎和早期发育各个阶段均有表达,从受精卵至囊胚期表达水平很低,在原肠胚期升高至中等表达水平,在刚孵出仔鱼中呈现最高表达水平;孵出后1d~25d,pf_c9mrna表达量显著下降至中等水平,孵出后30d表达量逐渐降低至较低水平。4.嗜水气单胞菌免疫后黄颡鱼pf_c8α、pf_c8β和pf_c9mrna表达量的变注射灭活嗜水气单胞菌后,黄颡鱼pf_c8αmrna表达量在检测的脾、中肾、头肾、肝和血液五种组织中都出现显著上调。在中肾和脾中,黄颡鱼pf_c8αmrna在注射免疫后12h出现最高表达。在肝脏中,pf_c8αmrna表达量在注射免疫后72h达到峰值。在头肾中,pf_c8αmrna表达量在注射免疫后12h显著上调并在24h达到峰值。在血液中,pf_c8αmrna表达量在注射免疫后72h~168h显著升高并在168h达到最高值。注射灭活嗜水气单胞菌后,黄颡鱼pf_c8βmrna表达量在检测的脾、中肾、头肾、肝和血液五种组织中都出现显著上调。在血液、中肾和脾中,黄颡鱼pf_c8βmrna表达量在注射免疫后120h出现显著上调,并在168h达到峰值。在肝脏中,pf_c8βmrna表达量在注射免疫后120h达到峰值。在头肾中,pf_c8βmrna表达量在注射免疫后24h达到峰值。注射灭活嗜水气单胞菌后,黄颡鱼pf_c9mrna表达量在检测的脾、中肾、头肾、肝和血液五种组织中都出现显著上调。在中肾和脾中,黄颡鱼pf_c9mrna在注射免疫后12 h出现最高表达。在肝脏中,Pf_C9 mRNA表达量在注射免疫后48 h达到峰值。在头肾中,Pf_C9 mRNA表达量在注射免疫后12 h显著上调并在24 h达到峰值。在血液中,Pf_C9 mRNA表达量在注射免疫后72 h~168 h显著升高并在168 h达到最大值。