目的:对犯罪现场发现的体液溯源,可以在样本来源者与实际犯罪行为之间建立联系,为现场重建提供重要证据。血痕是犯罪现场最常见的体液痕迹,而外周血与月经血仅凭外观难以区分。确定血痕是损伤性出血,还是女性正常的生理性出血,尤其是在性侵案或暴力损伤案件中,对于明确案件性质至关重要。环状RNA（circular RNAs,circRNAs）是一类不具有5’端帽子及3’端poly（A）尾巴结构、产生于RNA剪接过程中的单链共价闭合环状非编码RNA。circRNAs不易被核酸外切酶降解,较线性RNA更加稳定。研究表明,circRNAs在多种组织中含量丰富且表达水平具有组织特异性。本研究旨在通过二代测序方法筛选外周血与月经血中差异表达的circRNAs,应用qRT-PCR方法对候选circRNAs进行验证,以期为外周血与月经血的体液鉴别提供更为理想的分子标记。方法:1 样本采集及保存:用EDTA抗凝真空采血管收集3名女性无关个体（年龄19岁,26岁,26岁）每人外周血及月经血各9 m L,TRIzol处理（TRIzol:血液=3:1混匀）后,干冰运输,送公司测序;静脉穿刺收集20名女性无关个体（年龄18岁-35岁）外周血,并取同一个体月经血,各50μL制成血棉拭子,室温晾干后随即提取RNA,用于qRT-PCR验证试验;另采用同样的方法制备外周血及月经血血棉拭子,置于室温环境放置至3个月。收集3名女性个体尿液样本,同法制备棉拭子。2 RNA提取及定量:用TRIzol法提取上述外周血、月经血及尿液样本RNA,采用Nano Q微型分光光度计定量。3 二代测序方法筛选体液特异性circRNAs:二代测序及数据分析委托北京诺禾致源科技股份有限公司完成。采用Hi Seq PE150测序仪对3对外周血与月经血中的circRNAs进行检测,差异circRNAs的筛选标准为padj<0.05。4 qRT-PCR验证候选circRNAs:依据二代测序结果,综合考虑差异倍数、表达量等因素,筛选出在外周血和月经血中差异表达的24种候选circRNAs;分别在环化位点两侧设计反向（divergent）引物,通过qRT-PCR技术,检测候选circRNAs在外周血和月经血中的表达水平;记录C_T值（C_T值是指在指数增长阶段荧光报告基团的荧光信号达到阈值时所经历的PCR循环次数）,通过2^-ΔΔCT法(2^{-[ΔCT（月经血）-ΔCT（外周血）]})计算候选circRNAs在两种体液中的差异倍数;对在两种体液中表现为“全或无”特点的circRNAs的c DNA扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳;采用Sanger法测序验证24种circRNAs的PCR产物序列。5 灵敏度检验:对新鲜外周血和月经血中抽提的总RNA进行10倍系列梯度稀释,初始模板量分别加入100 ng、10 ng、1 ng、0.1 ng和0.01 ng,分析检测方法的灵敏度。6 circRNAs稳定性评估:对于经验证后筛选出的在外周血与月经血鉴别中有意义的circRNAs,采用qRT-PCR方法检测在室温环境放置1个月、2个月、3个月的外周血及月经血血棉拭子样本,初步评估circRNAs稳定性。7统计学分析:应用Excel及SPSS v21.0软件对上述实验结果进行单样本t检验、配对t检验及非参数检验等统计学分析。结果:1通过二代测序方法,三个个体外周血与月经血中共检测到49625种circRNAs,其中新发现的有36376种。三个体间共有的表达差异显著（padj<0.05）的circRNAs共509种,其中“全或无”表达的circRNAs160种（23种仅在外周血中表达,月经血中不表达;137种仅在月经血中表达,外周血中不表达）。2通过qRT-PCR和琼脂糖凝胶电泳技术验证24种在外周血和月经血中表达水平差异显著的circRNAs在20名个体中的表达情况,结果显示:4种circRNAs（hsa_circ₀000212,novel_circ₀013653,novel_circ₀013655,novel_circ₀013656）在17名个体（85%）中表现为“全或无”的特点,即仅能在月经血中检测到,在外周血中检测不到;在其余3名个体3次重复实验中,至少1次检测不到C_T值,其余2次C_T值均大于等于36;但其中novel_circ₀013653在尿液中也可检测到。12种circRNAs在外周血和月经血中的表达量差异具有统计学意义（P<0.05）,其中4种circRNAs（hsa_circ₀003203,hsa_circ₀004379,hsa_circ₀005616,hsa_circ₀067735）在月经血中的表达量相对于外周血的ΔΔC_T值均值在3.322以上,即在两种体液中的差异倍数达到10倍,但统计学结果显示只有hsa_circ₀067735的差异具有统计学意义（P<0.05）。其余8种circRNAs在两种体液中的表达量差异无统计学意义（P>0.05）。3尿液检验:24种circRNAs中除hsa_circ₀020093、novel_circ₀013653及hsa_circ₀087960可以在尿液中检测到外,其余21种均检测不到。4 Sanger测序:除novel_circ₀025468,novel_circ₀010813及novel_circ₀036457测序失败外,其余21个位点均测序成功,拼接位点位置均为预测的节点,且序列与二代测序结果一致。5 灵敏度检验:当加入0.1 ng总RNA时仍可检测到circRNAs,提示qRT-PCR方法检测的最低模板量为0.1 ng。6 circRNAs稳定性检验:室温保存1个月,2个月,3个月外周血斑中3种circRNAs（hsa_circ₀005616,hsa_circ₀067735,hsa_circ₀087960）的C_T值相比于新鲜外周血中有所增加,ΔC_T值基本一致;月经血斑中circRNAs（hsa_circ₀000212,novel_circ₀013653,novel_circ₀013655,novel_circ₀013656）相比于新鲜月经血样本C_T值几乎无变化,ΔC_T呈下降趋势。结论:本研究首次利用高通量测序方法分析了外周血与月经血circRNAs差异表达谱;验证了24种在两种体液中差异表达的circRNAs,并成功筛选出4种仅在月经血中表达的“全或无”特点的分子标记;评估了circRNAs在放置三个月之久的外周血和月经血样本中的稳定性,并发现了circRNAs在两种不同血液样本中的降解速率存在差异;研究构建的用于circRNAs定量的qRT-PCR方法检测灵敏度较高。实验结果表明,circRNAs具有较理想的稳定性和体液表达水平差异性,可以作为法医体液鉴别的新的遗传标记,继续深入研究。