胰腺癌是恶性程度极高的肿瘤,由于早期难于诊断,局部侵袭力高、早期易转移以及对化疗产生抵抗的特点,导致胰腺癌病人的预后非常差。手术治疗的复发率达20-25%,术后主要采用化疗药物吉西他滨或／和5-Fu治疗。但是由于化疗药物毒性及耐药等缺点,导致胰腺癌患者的治疗效果不佳,5年生存率仍小于5%。由于胰腺癌的发生是一个多基因异常引起的复杂病理过程。因此,干预多条信号通路的新靶点药物可能具有更大的治疗前景。热休克蛋白90(HSP90)作为重要的分子伴侣,能够辅助蛋白折叠、装配和成熟,维持多种信号传导蛋白的稳定,从而保持细胞生长和存活。大多数已鉴定的HSP90的客户蛋白是癌蛋白。如：跨膜的酪氨酸激酶(HER-2、EGFR、IGFR),信号蛋白(AKT、c-RAF、P53、 V-src)细胞周期调节者(CDK4、CDK6)和转录因子(STAT3和HIF-la)等,这些癌蛋白直接参与胰腺癌的生长和血管生成。HSP90在包括胰腺癌在内的许多肿瘤细胞中高表达,可达正常细胞的2-10倍,可使肿瘤中过度激活或突变的癌客户蛋白保持活性和避免降解,从而加速肿瘤增殖和恶性转变。阻断HSP90的分子伴侣功能,能够使许多癌蛋白同时失去稳定性并降解失活,达到“一靶多效”的抗癌效果。而且肿瘤细胞中具有特定的HSP90活性超伴侣复合体结构,使HSP90抑制剂的亲和力比对正常细胞高出100倍,这使得HSP90成为备受关注的抗肿瘤新靶点。HSP90是同源二聚体,每个单体包括三个高度保守的结构域：N端与ATP结合结构域(P1-E245)、中间结构域(K246-D528)和C端二聚化结构域(G529-D723)。ATP与HSP90 N末端结合以及ATP被HSP90 ATPase水解驱动HSP90构象循环,维持HSP90的活性。目前,大多数HSP90抑制剂是针对其N末端ATP结构域设计,其中一些已经进入临床前或临床抗肿瘤研究。格尔德霉素类(GAs)是最早被发现的HSP90抑制剂,其中17-AAG是经典的HSP90 N末端抑制剂,具有很强的抗肿瘤活性(IC50N达10-8-9M)。然而GAs存在很多不足,如严重的肝脏毒性、依赖体内醌还原酶NQO1P450 CYP3A4的代谢活化及易产生耐药等,限制了其临床应用。随着化学结构和高通量筛选技术地迅猛发展,一些具有嘌呤骨架或间苯二酚结构的HSP90抑制剂被开发,女PU3、CCT018159和VER-52296等。晶体衍射和构效关系研究表明,具有间苯二酚异噁唑结构的VER-52296可以嵌入HSP90ATP口袋,可显著地降低癌蛋白c-RAF和HER-2等,从而发挥广谱的抗肿瘤增殖作用。然而,研究显示VER-52296对正常细胞具有同样的活性。在期临床研究中,一些注射VER-52296的实体瘤患者出现了恶心、呕吐、夜盲等不良反应。因此,这部分课题的研究目标是建立筛选N末端HSP90抑制剂的荧光偏振体系；对80个具有全新结构的间苯二酚衍生物进行HSP90亲和活性的筛选,并评价其对肿瘤细胞的生长抑制作用；对候选化合物Y306zh进行体内、外抗肿瘤药效学评价；并阐明Y306zh抑制胰腺癌增殖的分子机制,为该类化合物的后续研发奠定坚实的实验基础。本研究工作由以下四部分内容组成：1)诱导并纯化人源重组HSP90a蛋白,建立用于HSP90抑制剂筛选的荧光偏振体系将pET24α(+)-HSP90a重组质粒转化至BL21(DE3),经1mM IPTG诱导蛋白表达,采用Ni-NTA亲和层析树脂纯化HSP90α蛋白。选用VER00051001为探针分子,检测不同浓度HSP90α蛋白或探针分子对荧光偏振值的影响,并采用HSP90抑制剂NVP-AUY922和GA验证荧光偏振体系是否建立成功。2)HSP90抑制剂的筛选随机地选择7种常用的人源性肿瘤细胞株,采用MTT法,对两批送样的具有间苯二酚三氮唑或异噁唑的80个化合物进行细胞毒检测。分别选取细胞毒活性较好的化合物,采用荧光偏振法对其与HSP90的亲和力进行初筛和复筛,得到候选化合物。其中,化合物Y306zh在酶学和细胞水平均显示出较好的活性,为此对其进行深入地抗肿瘤机制研究。3)候选化合物Y306zh的体内、外抗胰腺癌增殖作用研究采用MTT法,检测了Y306zh对15株人肿瘤细胞株的生长抑制作用,筛选出Y306zh的敏感瘤株为胰腺癌。并检测Y306zh对五株具有不同程度HSP90a表达的胰腺癌细胞和正常细胞的生长抑制作用。采用流式细胞术检测Y306zh对胰腺癌细胞周期阻滞,及诱导胰腺癌细胞凋亡的作用。在胰腺癌Mia-paca2细胞的裸鼠异体移植瘤实验中,通过检测荷瘤鼠体重、瘤体积和瘤重的变化,以及瘤组织中增殖指标Ki-67的阳性率,来评价Y306zh的体内抗胰腺癌作用。4)Y306zh抑制胰腺癌增殖的分子机制研究采用荧光偏振技术检测Y306zh与HSP90 N末端的亲和力。采用ATP琼脂糖小球结合实验和免疫共沉淀实验分别检测Y306zh对胰腺癌细胞内ATP结合型的HSP90活性形式及HSP90与辅助分子伴侣p23、CDC37的相互作用。采用免疫印迹实验检测Y306zh对胰腺癌发生发展密切相关的两个重要客户蛋白EGFR和IGF-1Rβ的表达,及其下游PI3K/AKT和MAPK信号通路中关键分子蛋白表达的影响。预先给予蛋白酶体抑制剂MGl32,检测是否逆转Y306zh对客户蛋白EGFR、IGF-1Rβ、AKT、c-RAF和CDK4的降解作用。采用免疫共沉淀实验检测Y306zh诱导客户蛋白的泛素—蛋白酶体降解是否与HSP90-HSP70-CHIP-客户蛋白复合体的形成相关。综上所述,本课题取得的主要进展如下：1)采用pET24a(+)-HSP90a原核表达系统,成功地诱导表达并纯化了具有活性的HSP90a蛋白,建立并优化了用于HSP90抑制剂筛选的荧光偏振体系。2)从80个具有间苯二酚三氮唑或异噁唑结构的化合物中筛选出24个化合物,它们对肿瘤细胞生长抑制作用的IC50值在10-6-10-7M。并且绝大多数化合物(～20个)可与VER00051001竞争性结合HSP90,IC50值在10-7-10"8M。3)Y306zh是一种全新结构的有效的HSP90抑制剂,具有较好的体内、外抗胰腺癌作用,并且具有较好的肿瘤选择性和安全性。4)Y306zh可以通过抑制ATP与HSP90的结合,并阻碍p23与HSP90的相互作用,从而抑制HSP90的分子伴侣活性,导致胰腺癌中优势客户蛋白IGF-1Rβ和EGFR去稳定化,并抑制其介导的PI3K/AKT和MAPK两大增殖／存活信号通路,发挥抗胰腺癌增殖作用。