FOXS1通过Hedgehog信号通路促进前列腺癌细胞恶性生物学行为的机制研究

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背景:WHO近期的统计结果显示,前列腺癌(Prostate cancer,PCa)的发病率在男性肿瘤中位列第二,其全球新发人数每年可达140万,较高的发病率导致了前列腺癌是男性最常见的肿瘤致死性疾病之一。前列腺癌发病率的高低与地域因素密切相关,美国及加拿大为代表的西方国家前列腺癌尤其高发,美国男性前列腺癌的终身风险可达12%,远远超过我国。随着近年来前列腺特异性抗原(Prostate-specific antigen,PSA)的广泛应用及其他检查手段的普及,我国前列腺癌的发病率及检出率逐年升高,并有多个研究提出该病逐渐呈现年轻化趋势。目前的研究结果表明遗传、年龄、种族、饮食、体重及吸烟等因素均与前列腺癌的发生发展相关,但致使前列腺癌发生发展的机制在分子层面仍然存疑,因此很大程度上影响了前列腺癌的治疗效果。目前常用的手术治疗、化学治疗及内分泌治疗等方案均有各自的局限性,故而相关研究人员迫切希望在前列腺癌发生发展的分子机制层面取得研究进展,以期将结果应用于临床达到更好的治疗效果。FOXS1是FOX蛋白家族成员之一。该家族是一类进化上保守的转录因子,因含有叉头盒结构的DNA结合域(DNA-binding domain,DBD)而得名。FOX家族在代谢、凋亡、发育、增殖、分化、侵袭及细胞永生化等多个生物学进程中均发挥作用。目前研究表明FOX蛋白家族的异常表达与多种癌症的发生发展密切相关,但该家族对肿瘤细胞的影响千差万别,具体取决于细胞系的类型及家族分子的种类,如,FOXF2通过FOXF2-IRF2BPL-β-catenin信号轴抑制了胃癌的发生发展,而FOXM1则明显促进了胰腺癌的侵袭、转移及EMT。FOXS1的特性亦是如此,在神经管细胞瘤中其过表达可通过Hedgehog(Hh)通路抑制肿瘤的发生发展,而于胃癌中其过表达则促进肿瘤的进展及EMT的发生,但现今仍无研究表明其对前列腺癌细胞系的作用。Hedgehog(Hh)信号通路在胚胎发育中不可或缺,另有许多研究显示这一信号传导途径与肿瘤的进展关系密切。HH蛋白家族在Hh信号通路中的作用十分关键,其成员包括SHH、DHH及IHH。SHH与细胞增殖密切相关,其通过与受体PTCH相结合激动Hh信号通路。Gli1位于HH级联反应的末端,是Hh信号通路的重要因子,其可影响多个肿瘤细胞系的发生发展。Hh通路对前列腺癌的发生发展存在重要影响,研究表明该通路的激活可使前列腺癌的增殖、侵袭等恶性生物学行为明显增强。目的:目前尚无研究表明FOXS1对前列腺癌细胞系的作用,亦不知其通过何种途径调控前列腺癌的发生发展。本研究将TCGA、GEO数据分析与生物学试验相结合,用以明确FOXS1对前列腺癌细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡等能力的影响,进而探究其是否通过Hh信号通路发挥了生物学作用,最后于裸鼠体内观察FOXS1对前列腺癌细胞系生物学行为的影响,以期能为临床找到新的治疗靶标,从而为前列腺癌的治疗提供新思路。研究方法:本研究利用edge R及Wilcoxon秩和检验分析TCGA-PRAD及GEO数据库中前列腺癌与前列腺正常组织的差异基因,并通过KS检验分析差异基因的表达变化与Gleason评分、肿瘤分期分级、生化复发及抑癌基因突变之间的关系,从而筛选出可用于研究的分子。免疫组化法(Immunohistochemistry,IHC)测定86例人前列腺癌组织及12例癌旁前列腺组织中FOXS1的表达量,并用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR)及蛋白印迹法(Western blot,WB)分别测定RWPE-1、C4-2、PC-3、C4-2B及DU145细胞系中FOXS1的RNA含量及蛋白表达量,从而确定FOXS1为本研究的靶向分子。综合上述两项实验结果选取C4-2细胞系转染FOXS1过表达质粒构建FOXS1过表达细胞系C4-2-FOXS1OE,选取DU145细胞系转染小干扰RNA(Small interfering RNA,si RNA)构建FOXS1敲减细胞系DU145-si FOXS1,并通过RT-q PCR、WB及免疫荧光法(Immunofluorescence,IF)测定过表达及敲减细胞系中FOXS1的表达量,从而明确是否成功构建细胞系以便进行后续试验。成功构建相应细胞系后采用细胞计数试剂盒-8(Cell counting kit-8,CCK-8)及平板克隆实验检测FOXS1基因的敲减及过表达对前列腺癌细胞系增殖情况的影响;采用Transwell侵袭试验检测FOXS1基因的敲减及过表达对前列腺癌细胞系侵袭情况的影响;采用伤口愈合试验检测FOXS1基因的敲减及过表达对前列腺癌细胞系迁移情况的影响;采用流式细胞技术检测FOXS1基因的敲减及过表达对前列腺癌细胞细胞系凋亡情况的影响,并通过WB测定E-cadherin、N-cadherin、Vimentin及β-catenin的表达量检测FOXS1的敲减及过表达对前列腺癌细胞EMT的影响。为进一步明确FOXS1是否通过Hh通路发挥分子生物学作用,遂通过WB测定Hh通路明星分子SHH、PTCH1、SMO及Gli1的表达量,从而检测FOXS1的敲减及过表达对前列腺癌细胞系Hh通路的影响。SAG为为Hh信号通路激动剂,SAG 100n M及DMSO分别处理对应组别细胞24h后,将细胞系分DU145对照组(DU145-si Control)+DMSO、DU145-si Control+SAG、DU145-si FOXS1+DMSO及DU145-si FOXS1+SAG四组,通过WB测定上述四组前列腺癌细胞SHH、PTCH1、SMO、Gli1、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin及β-catenin的表达量,并检测上述四组细胞系增殖、迁移、侵袭能力的变化,从而明确SAG是否对FOXS1基因的敲减效应存在回复作用,以判断FOXS1是否通过Hh通路发挥生物学作用。将12只BALB/c裸鼠随机等分成2组,并向2组裸鼠腋下分别注射DU145-si Control、DU145-si FOXS1细胞系以构建移植瘤模型。试验过程中规律测量小鼠的体重及肿瘤体积,将小鼠安乐死后取移植瘤测量体积及湿重并将肿瘤石蜡包埋制备切片。IHC测定两组小鼠移植瘤FOXS1、Gli1的表达量,从而在体内验证FOXS1的表达变化对Hh通路及前列腺癌细胞系增殖能力的影响。结果:本研究采用edge R和Wilcoxon秩和检验对TCGA-PRAD和GEO70770进行了分析,结果提示FOXS1在前列腺癌组织中的表达量高于正常前列腺组织,并通过KS检验发现FOXS1的表达水平与Gleason评分、肿瘤分期及TP53的突变率成正相关,且其异常过表达常伴随前列腺癌生化复发出现时间的提前。IHC结果表明,FOXS1在人前列腺癌中的表达水平明显高于正常前列腺组织,并且FOXS1表达水平与Gleason评分之间存在显著的正相关。RT-q PCR结果显示,C4-2、PC-3、C4-2B和DU145细胞系中FOXS1的表达水平明显高于人类正常前列腺细胞系RWPE-1(P<0.05),WB结果与RT-q PCR一致。通过RT-q PCR、WB及IF确定已成功构建C4-2-FOXS1OE及DU145-si FOXS1细胞系并开始后续实验。C4-2-FOXS1OE细胞系与对照组C4-2-Vector细胞系相比,细胞增殖、侵袭及迁移能力明显上升,细胞凋亡减少,E-cadherin表达量下降、N-cadherin、Vimentin及β-catenin的表达量升高。DU145-si FOXS1与对照组DU145-si Control相比,细胞凋亡增多,细胞增殖、迁移及侵袭能力明显下降,E-cadherin表达量上升,Vimentin、N-cadherin及β-catenin的表达量下降。C4-2-FOXS1OE细胞系与对照组C4-2-Vector细胞系相比,SHH、PTCH1、SMO及Gli1的表达量明显上升。DU145-si FOXS1与对照组DU145-si Control相比,SHH、PTCH1、SMO及Gli1的表达量明显下降。SAG处理后,DU145-si FOXS1+SAG及DU145-si Control+SAG组SHH、PTCH1、SMO、Gli1、Vimentin、N-cadherin及β-catenin的表达水平均高于各自对照组,而E-cadherin表达水平则较各自对照组降低。检测上述四组细胞的增殖、迁移、侵袭能力的变化后发现,SAG可部分回复FOXS1的敲减对前列腺癌细胞系造成的抑制作用。裸鼠成瘤试验中发现,DU145-si FOXS1组的移植瘤体积、湿重均低于DU145-si Control组。移植瘤IHC结果表明,DU145-si Control组FOXS1、Gli1的表达量均高于DU145-si FOXS1组。结论:本研究首次明确了FOXS1对前列腺癌发生发展的影响及其发挥作用的潜在分子生物学机制。体外实验结果表明FOXS1的异常过表达可通过Hh信号通路促进前列腺癌细胞系的增殖、迁移、侵袭能力并加速前列腺癌细胞系EMT的发生,而Hh信号通路激动剂SAG可部分逆转FOXS1敲减对前列腺癌细胞系的抑制作用。体内实验结果与体外实验类似,进一步佐证了FOXS1的异常过表达可通过Hh信号通路加速前列腺癌的进展,故而FOXS1有望成为前列腺癌诊断治疗的新靶点,为前列腺癌的诊疗提供了新思路。
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