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目的:麻黄细辛附子汤（简称MXF）是治疗太少两感（肾阳虚外感）的经典方剂,课题组前期已证实MXF对肾阳虚外感小鼠模型有较好的干预作用,本课题组开展了麻黄细辛附子汤多糖（MXF多糖）干预肾阳虚外感小鼠的药效及作用机制研究,以探索MXF治疗流感类疾病的作用药效物质基础及机理。方法:1.利用水提醇沉法提取MXF（麻黄:细辛:附子,3:3:6）中复方多糖及各单味药多糖,苯酚硫酸法测定多糖含量,考马斯亮蓝法测定蛋白含量,气相色谱法测定麻黄多糖、细辛多糖、附子多糖、MXF多糖的单糖组成。2.肾阳虚外感小鼠模型肺组织管家基因的筛选:Balb/c小鼠（10只）以4mL/kg腹腔注射2mg/mL苯甲酸雌二醇,每日1次,连续7d,复制肾阳虚模型,测定自主活动、体重、肛温、游泳时间,以此判定模型成功与否;另选10只Balb/c小鼠作为正常组小鼠,注射等量的生理盐水。对肾阳虚模型小鼠麻醉后滴鼻感染流感病毒H1N1鸡胚尿囊液（TCID50 2.34×108）20μL/只,滴鼻1次;正常组滴鼻等量的生理盐水。滴鼻感染后小鼠隔离喂养,观察7d后,脱颈椎处死,解剖称取肺组织等计算脏器指数。利用Real Time PCR检测15种参比基因在肺组织中的表达稳定性,利用geNorm、NormFinder和Bestkeeper分析方法分别评估15个参比基因。3.MXF多糖体内抗流感病毒的药效研究:（1）Balb/c雄性小鼠70只,正常组10只,其余小鼠以4mL/kg腹腔注射2mg/mL苯甲酸雌二醇,每日1次,连续7d,复制肾阳虚模型,H1N1流感病毒滴鼻感染,分别建立正常外感模型和肾阳虚外感模型,模型组随机分为正常外感模型组、正常外感MXF组、正常外感MXF多糖组、肾阳虚外感模型组、肾阳虚外感MXF组、肾阳虚外感MXF多糖组;分别灌胃给药MXF和MXF多糖,MXF剂量为1.8 g·kg-1·d-1相当于人临床等效剂量,MXF多糖剂量为65mg·kg-1·d-1,正常组灌服等体积的生理盐水,每天1次,连续6 d,每日测定体重、肛温;解剖后,取肺、胸腺、脾脏、肝脏、肾脏、肾上腺、精囊腺、睾丸,计算脏器指数,采用偏最小二乘判别分析法分析比较MXF多糖与MXF全方的药效差异。（2）Balb/c小鼠80只,正常组10只,其余小鼠以4mL/kg腹腔注射2mg/mL苯甲酸雌二醇,每日1次,连续7d,复制肾阳虚模型,H1N1流感病毒滴鼻感染,建立肾阳虚外感模型,建立的模型随机分为模型组、MXF组、MXF多糖组、麻黄多糖组、细辛多糖组、附子多糖组、剔除多糖组;MXF剂量为1.8 g·kg-1·d-1相当于人临床等效剂量,MXF多糖(120 mg·kg-1·d-1)、麻黄多糖(20 mg·kg-1·d-1)、附子多糖(73.2 mg·kg-1·d-1)、细辛多糖(77 mg·kg-1·d-1)、剔除多糖(130 mg·kg-1·d-1),每日灌胃0.4 mL,正常组和模型组灌胃等体积的生理盐水,连续给药6天后处死,解剖后取肺、胸腺、脾脏、肾上腺、精囊腺,计算脏器指数;利用RT-PCR法测定肺组织中H1N1的M基因拷贝数以及多个抗炎、促炎细胞因子mRNA的相对表达,利用流式细胞CBA技术从蛋白水平测定肺组织上清液中多细胞因子表达。4.MXF多糖及单味药多糖体外抗病毒活性及体外免疫活性实验:采用CCK8法测定麻黄多糖、细辛多糖、附子多糖、MXF多糖体外抗H1N1流感病毒的活性;采用MTT法测定MXF多糖和单味药多糖对小鼠脾脏细胞、巨噬细胞增殖作用的影响;结果:1.测定多糖含量的标准曲线为Y=0.0135X-0.0314,蛋白含量的标准曲线为Y=5.0853X-0.0482,测得MXF多糖、麻黄多糖、细辛多糖、附子多糖含量分别为57.48%、11.21%、25.22%、83.56%;蛋白含量分别为1.640%、1.560%、0.800%、1.441%;麻黄多糖单糖组成为D-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖;细辛多糖单糖组成为L-鼠李糖、D-阿拉伯糖、D-木糖、D-葡萄糖、D-半乳糖;附子多糖单糖组成为D-阿拉伯糖、D-木糖、D-葡萄糖、D-半乳糖;MXF多糖单糖组成为D-阿拉伯糖、D-木糖、D-葡萄糖、D-半乳糖。2.与正常组相比,模型组小鼠体重和肛温明显降低,肺指数升高,肺组织中H1N1的M基因绝对拷贝数6.1×106/ml以上,表明肾阳虚外感模型构建成功;15种参比基因的相关系数均大于0.990,扩增效率在91%-98.9%之间,可用于参比基因的稳定性评价;BestKeeper软件分析结果为Nedd8基因的稳定性最好,而β2m基因的稳定性最差;geNorm软件分析结果为Ywhea和Tuba基因的稳定性最好,而β2m基因的稳定性最差;NormFinder软件分析结果为18SrRNA基因的稳定性最好,而β2m基因的稳定性最差;采用双基因两两组合的方法,并对两两组合的双基因在正常组和模型组之间的基因表达差异进行T检验,其中Grcc10+Ppia组合P值最大为0.986,且平均值差值最小为0.009,可作为病证结合的肾阳虚外感小鼠模型肺组织标本管家基因的最优选择。3.（1）通过各组PLS相关性分析综合药效得分可以看出,与正常组相比,其余各组综合药效得分值显著降低（P<0.01）;与肾阳虚外感模型组相比,正常外感模型组、正常外感MXF组、正常外感MXF多糖组综合药效得分值升高;肾阳虚外感MXF组与肾阳虚外感MXF多糖组的综合药效得分值明显高于肾阳虚外感模型组（P<0.01）。（2）肾阳虚小鼠接种病毒后,体重、肛温呈下降趋势,给药后,MXF组和MXF多糖组体重和肛温均出现回升趋势,MXF、MXF多糖组和细辛多糖组中甲型流感病毒H1N1的M基因mRNA相对表达量显著降低（P<0.05）;检测细胞因子的基因表达,发现MXF多糖可降低肾阳虚外感小鼠肺组织TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-27的mRNA的相对表达,但无显著性差异,MXF多糖可显著降低IL-6（P<0.05）、MCP-1（P<0.05）、IFN-β（P<0.01）的mRNA的相对表达,MXF多糖还可升高IL-10、IFN-γ的相对表达量;测定细胞因子的蛋白含量,经给药治疗后,MXF多糖组的IL-10、IL-23、IL-1β、MCP-1、IFN-γ含量降低程度大于MXF全方,但无显著性差异;单味药多糖中,细辛多糖可显著降低细胞因子含量。4.采用CCK8法测定各多糖和利巴韦林在体外实验中抗H1N1流感病毒的IC50,麻黄多糖、细辛多糖、附子多糖、MXF多糖、利巴韦林对MDCK细胞的IC50分别为0.0221 mg/mL、0.008775 mg/mL、0.7516 mg/mL、0.03046 mg/mL、02032 mg/mL,TI值分别为4.009、14.24、13.30、13.09、4.208;MXF多糖在浓度为250μg/mL和15.6μg/mL时对小鼠脾脏细胞和巨噬细胞增殖的促进作用最明显（P<0.01）,麻黄多糖、细辛多糖、附子多糖浓度分别在250μg/mL和31.25μg/mL（P<0.01）、62.5μg/mL（P<0.05）和31.25μg/mL（P<0.01）、25μg/mL（P<0.05）和100μg/mL（P<0.01）时对脾脏细胞和巨噬细胞有显著的增殖作用。结论:中药复方MXF多糖对于肾阳虚外感小鼠模型具有良好的干预作用。MXF多糖和细辛多糖可降低肾阳虚外感小鼠的肺指数,显著降低肾阳虚外感小鼠肺组织中H1N1的M基因的拷贝数;单味药及复方多糖都对小鼠脾脏细胞和巨噬细胞都有显著的增殖作用。MXF多糖和细辛多糖通过调节TNF-α、IL-6、IL-27、IFN-β、IL-17、MCP-1等细胞因子来降低机体炎症反应,表明MXF多糖及细辛多糖可有效调节相关信号通路,降低流感病毒感染所致炎症反应。采用PLS相关性分析综合药效比较后,MXF多糖是MXF抗流感类疾病重要的药效物质基础之一。