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研究目的:尿液作为一种人体代谢废弃物,其中可能存在着疾病早期被体内排泄的信号分子。通过对肺癌病人和正常人尿液中游离miRNAs的分离及高通量测序,探讨两组间miRNAs的表达差异及在肺癌早期诊断中的价值。研究方法:(1)收集已确诊的肺癌病人尿液及健康人尿液各5例,5000rpm离心15min后取上清分离游离总RNA。(2)将提取的RNA送至测序公司,选取质量合格的样品和对照各3个构建文库并进行miRNAs高通量测序。(3)根据测序结果,选取差异表达的miRNAs,参考TargetScan、miRDB和miTarBase这3个数据库分析其可能调控的靶基因并进行信号通路富集分析。(4)根据肺癌相关通路中的靶基因预测与肺癌发生有关的miRNAs。(5)收集已确诊的肺癌病人尿液23例、健康人尿液22例,提取游离总RNA,利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法,验证这些miRNAs是否在肺癌病人中具有普遍的表达差异。(6)ROC曲线分析游离miRNAs与肺癌的关联度以及在肺癌诊断中的价值。研究结果:(1)尿液中游离总RNA的含量和质量均满足测序要求,可以用于高通量测序;(2)测序得到的小RNA中包含已知miRNAs以及未比对到数据库但是可以根据前体的发卡结构来预测的miRNAs;(3)两组间差异表达的已知miRNAs共133个(p值<0.05且FC值≠1),其中高表达共73个,低表达60个;(4)差异表达miRNAs中最为显著的36个(p<0.001且FC值>1.5),可能调控的靶基因共172个;(5)将这些靶基因在KEGG通路中富集分析,得到7个与肺癌发生相关的靶基因(MAPK1、CDKN1A、E2F2、CCND1、STAT3、MAP2K1、GRB2),这些靶基因受3个miRNAs(miR-20b-5p、miR-378a-3p、miR-34a-5p)的调控;(6)实时荧光定量检测肺癌病人和正常人尿液中这3种游离miRNAs的表达水平,结果表明miR-20b-5p在肺癌病人尿液中高表达(4.054±0.306),miR-378a-3p和miR-34a-5p的相对表达量分别为0.563±0.041、0.8212±0.059,低于对照组,结果均与测序结果一致;(7)ROC曲线显示,miR-20b-5p的曲线下面积(AUC)最大为0.921,其约登指数为0.779,敏感性和特异性分别为87.0%和90.9%,具有较高的诊断准确性;miR-378-3p的AUC为0.836约登指数为0.648,敏感性和特异性分别为90.9%和73.9%,也具有一定的诊断准确性,但是miR-34a-5p的AUC足0.7且p值>0.01,诊断价值不明显。研究结论:肺癌病人尿液中存在有稳定的游离miRNA,与正常人比较,其水平具有差异性。在差异性存在的miRNA中,miR-20b、miR-378a和miR-34a差异性显著。miR-20b的表达量高于健康人,而miR-378a、miR-34a表达量则低于常人。尿液中这三种游离miRNA可能与肺癌的发生有着密切关系,而miR-20b和miR-378a的变化具有较大的诊断肺癌参考价值。