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随着生活水平的不断提高,人们对畜产品特别是猪肉产品的品质要求越来越高,如何降低脂肪沉积改善肉产品品质已成为困扰养殖业的新问题。大量的研究证实,通过添加植物提取物等可有效的改变畜体脂肪酸组成,抑制腹脂沉积,改善肉的风味。人和实验动物的研究结果表明,大豆中普遍存在的异黄酮类植物雌激素在降低血脂、抑制脂肪沉积等方面有积极的作用,且无明显的毒副作用,在调节体脂组成,改善胴体品质等方面有广阔的应用前景。大豆苷是大豆中存在的一种主要的异黄酮类植物雌激素,可在动物肠道内糖苷酶的作用下降解为有活性的大豆苷元,后者可在特异性肠道微生物的作用下代谢为具有更高生物活性的雌马酚,它们与内源雌激素均具有相似的结构,在体内发挥类雌激素作用。本文旨在通过在无豆日粮基础上单独灌胃大豆苷元、雌马酚或将大豆苷元及雌马酚产生菌共同灌胃的方式研究其对模型动物SD大鼠生长性能、血液及肝脏脂质含量变化、肝脏脂代谢相关酶活的影响,以阐明引入外源的雌马酚产生菌能否提高大豆苷元对机体脂质水平及脂代谢调节的影响,并通过体外细胞培养对其调控机制及雌激素受体依赖性进行进一步探讨,以期为大豆苷元及其降解菌在畜产品脂代谢调控中的应用提供理论依据。本试验分为三部分：试验一：大豆苷元及其降解产物雌马酚对SD大鼠脂代谢的影响本试验在雌性大鼠采食无豆日粮的基础上,通过单独灌胃适量的大豆苷元、雌马酚及共同灌胃大豆苷元和雌马酚产生菌zx-7,研究其对SD大鼠生长性能、血脂变化、肝脏脂质含量及脂代谢相关酶活的影响,以阐明引入外源的雌马酚产生菌能否提高大豆苷元对SD大鼠脂代谢的影响。试验选用30只平均体重211±9g的75日龄的雌性SD大鼠,随机分成5组,每组6只。各组在无豆日粮基础上每天做如下处理：对照组,灌胃灭菌蒸馏水1mL；雌二醇组,灌胃雌二醇0.2mg；大豆苷元组,灌胃大豆苷元10mg；雌马酚组,灌胃雌马酚10mg；大豆苷元+菌组,灌胃大豆苷元10mg,并在试验1、2、3及21日时灌胃雌马酚产生茵ZX-7菌液1mL。试验期为42天。试验开始和结束后分别称量每只大鼠的体重,试验过程中记录各笼的采食量,以计算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F：G)。试验结束后测定体脂、血液及肝脏中脂质含量和肝脏中脂代谢相关酶活性。结果显示,与对照组相比,各处理组SD大鼠的体重和肝脏重及体脂含量均有不同的程度降低,其中雌马酚组的体重较对照组有显著降低(P<0.05)。各处理对ADFI和F：G均无显著影响(P>0.05)。血脂测定结果表明,大豆苷元可以显著降低血液中总胆固醇(TC)的含量和低密度脂蛋白胆固醇/高密度脂蛋白胆固醇(LDL-c/HDL-c)的比值(P<0.05)；雌马酚对血液中TC、LDL-c/HDL-c、游离脂肪酸(NEFA)水平均有显著的下调作用(P<0.05),但同时会使血液中甘油三脂(TG)的含量显著升高(P<0.05)；大豆苷元+菌ZX-7可显著降低血液中TC及LDL-c含量(P<0.05)；各处理组对肝脏TG含量均具有显著下调作用(P<0.05),其中雌马酚对肝脏TC、TG及NEFA水平的抑制作用均达到了显著水平(P<0.05)。肝脏脂代谢相关酶活结果显示：大豆苷元、雌马酚及大豆苷元+菌ZX-7均可显著提高总酯酶酶活(TL=LPL+HL),同时抑制苹果酸脱氢酶(MDH)的活性(P<0.05)。由此可知,大豆苷元及其降解产物雌马酚均可抑制体重增长,降低体脂含量,促进大鼠肝脏中TC、TG的转运和利用,抑制脂肪在肝脏内的堆积,雌马酚较其前体大豆苷元在脂代谢调节中表现出更高的生物活性,外源灌胃雌马酚产生菌株zx-7可有效增强大豆苷元对机体脂肪沉积的抑制作用。试验二：大豆苷元及其降解产物雌马酚对HL-7702细胞胆固醇代谢相关基因表达的影响本试验以正常人肝细胞HL-7702为对象,通过研究不同浓度的大豆苷元及其降解产物雌马酚(0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L和50μmol/L对HL-7702细胞活性及胆固醇代谢相关基因表达的影响,比较分析大豆苷元及其代谢产物雌马酚对肝细胞生长的影响及其在胆固醇代谢中的调控作用与机制。MTT法结果显示,大豆苷元及雌马酚在HL-7702细胞增殖活性的调节中表现出较为明显的剂量效应,0.1和1μmol/L大豆苷元和雌马酚均可显著促进细胞的增殖(P<0.01),10和50μmol/L大豆苷元及10μmol/L雌马酚无显著促进细胞增殖的作用,50μmol/L雌马酚则对细胞增殖表现出明显的抑制作用(P<0.01)。荧光定量PCR检测细胞中胆固醇代谢相关基因LDL-R(低密度脂蛋白受体)、SREBP-2(固醇调节元件结合蛋白-2)和HMGCR (3-羟基-3-甲基-辅酶A还原酶)基因的表达量结果显示,50μmol/L大豆苷元及雌马酚均可极显著的促进细胞内LDL-R和HMGCR基因的表达(P<0.01),且雌马酚的作用强度要高于大豆苷元。大豆苷元及雌马酚对SREBP-2基因的表达均有一定的促进作用,但未达到显著水平(P>0.05)。由试验结果可知,大豆苷元及雌马酚对肝细胞内胆固醇代谢调节作用的发挥可能是通过调节多个胆固醇代谢相关基因的表达来共同实现的,且不同基因对药物浓度的敏感性不同。在低浓度下,大豆苷元及雌马酚可能通过激活细胞内SREBP-2途径进而实现对其所调控的胆固醇代谢相关的下游靶基因的靶向调控作用,同时可能通过抑制肝细胞内HMGCR的表达进而抑制细胞内胆固醇的合成,抑制胆固醇在肝细胞内的累积。在高浓度水平下,大豆苷元及雌马酚可能通过促进肝细胞表面LDL-R基因的表达,以促进血浆中胆固醇的清除。且在对LDL-R基因的表达调控中,雌马酚较大豆苷元表现出更高的活性。试验三：大豆苷元及其降解产物雌马酚对HL-7702细胞胆固醇代谢相关基因表达调控的雌激素受体依赖性分析本试验以正常人的肝细胞HL-7702为对象,观察大豆苷元和雌马酚对细胞内胆固醇代谢相关基因LDL-R、SREBP-2和HMGCR的表达调控是否受雌激素受体拮抗剂(ICI182,780)的阻断,以初步探讨大豆苷元及其代谢产物雌马酚对正常人肝细胞HL-7702中LDL-R、SREBP-2和HMGCR基因表达调控的雌激素受体依赖性。根据试验2的结果对三个基因的受体依赖性分析分别作不同的分组处理。LDL-R:Control、50μmol/L Daidzein、50μmol/L Equol、50μmol/L Daidzein+50μmol/L ICI182,780、50μmol/L Equol+50μmol/L ICI182,780; SREBP-2:Control、0.1μmol/L Daidzein、0.1μmol/L Equol、0.1μ.mol/L Daidzein+0.1μmol/L ICI182,780、0.1μmol/L Equol+0.1μmol/L ICI182,780; HMGCR:Control、0.1μmol/L Daidzein、01μmol/L Equol、0.1μmol/L Daidzein+0.1μmol/L ICI182,780、0.1μmol/L Equol+0.1μmol/L ICI182,780。处理24小时后,收集细胞并用荧光定量PCR检测细胞中LDL-R、SREBP-2、HMGCR基因的表达量变化。结果发现,50μmol/L大豆苷元及雌马酚对HL-7702细胞内LDL-R表达促进作用在加入等浓度的雌激素受体拮抗剂后消失,表明大豆苷元及雌马酚对HL-7702细胞内LDL-R表达的促进作用可能依赖于细胞内雌激素受体的表达。大豆苷元及雌马酚在0.1μmol/L的低浓度水平下均可不同程度的促进HL-7702细胞内SREBP-2的表达,但均未达到显著水平(P>0.05),加入相同浓度的拮抗剂后,大豆苷元对SREBP-2基因的表达上调作用基本消失,而雌马酚组中SREBP-2的表达量却显著升高(P<0.05),这一结果说明,大豆苷元及雌马酚在对HL-7702细胞内SREBP-2的表达调控中可能不完全依赖于细胞内雌激素受体。在低浓度水平下,大豆苷元及雌马酚均可显著降低肝细胞内HMGCR的表达(P<0.05),加入雌激素受体拮抗剂后,这种表达抑制作用基本消失,揭示大豆苷元及雌马酚对肝细胞内HMGCR的表达抑制作用的发挥可能要依赖于其中ER的表达。