研究背景及目的骨组织工程是模拟体内生理性骨再生的过程,血液系统与骨发生发育有着分子信号机制上的联系,对两者分子机制的深入探讨有助于推动骨组织工程的发展。G蛋白偶联受体（GPCR）是细胞接受外界信号并传给胞内转录因子的第一闸门,通过转录因子调节各种细胞生物学功能。G蛋白偶联受体48（GPR48）基因敲除小鼠胚体除了表现出明显的骨骼发育迟滞外,还有贫血迹象,这种表型提示骨骼和造血之间存在某种分子联系,但这种详细的信号机制目前并不清楚。因此研究GPR48信号通路在造血和骨骼发育之间的分子联系,有助于对骨再生机制有更好的理解。近些年来,血液中不同成分,尤其是血小板成分,在骨再生修复过程中所发挥的重要作用也引起越来越多的关注。血小板被凝血机制激活后,可释放多种生长因子,调控包括成骨细胞和破骨细胞等各种细胞的增殖分化,高效调节修复初期的骨再生。血小板这种功能的激活和维持,有赖于GPCR经多种信号转导的正常调控,因此,通过GPCR信号通路的分子联络,血小板构成了血液系统和骨再生发育之间的重要桥梁之一。新近研究的血小板裂解液（PL）是血小板衍生物,承载大量生长因子,抗原物质少,制备容易,具有高效丝裂原效应,可能成为用于骨组织工程中生长因子的重要来源。本研究目的旨在:1、探讨血液成分和骨组织之间的分子信号联络:GPR48基因失活小鼠在胚胎红系造血和骨发育调节中的共同分子信号通路;2、将血邪辶呀庖鹤魑ひ蜃釉靥?用于骨组织工程学方法,评价其在体内外对骨再生的影响。材料和方法1胚胎红系造血和骨发育的共同分子信号通路研究1.1 GPR48基因靶向灭活小鼠品系的建立、基因型的确定及表达利用基因分泌捕获方法建立GPR48基因靶向灭活的小鼠品系（129×C57BL/6）,将GPR48杂合体雌雄小鼠交配饲养繁殖获得纯合突变小鼠子体,取孕中期12.5-14.5天（E12.5-E14.5）的杂合体雌鼠剖离胚胎做相关研究。提取胎鼠尾DNA用PCR方法鉴定胚胎的基因型,区分GPR48野生型（WT,+/+）、杂合突变型（HE,+/-）和纯合突变型（HO,-/-）小鼠。用LacZ组织特殊染色观察GPR48在E14.5 WT、HO小鼠骨骼和肝脏的表达差异。1.2体征观察观察E12.5-E14.5胎鼠胚体和肝脏的体态大小、颜色、活动等一般情况。1.3外周血红细胞及血红蛋白分析制E12.5-E14.5外周血涂片,Wright-Giemsa染色,光镜下观察红细胞形态变化。对E13.5（WT 8只,HO 7只）和E14.5（WT 5只,HO 4只）血涂片,每只取3张血片,每张血片随取3个高倍视野,高倍镜（×400）计数单个视野的有核红细胞、无核红细胞及红细胞总数,计算有核红细胞在红细胞总数中所占比例,比较统计学差异;Real-time PCR检测E13.5 WT和HO各6例胎鼠外周血中βh1和β血红蛋白链的mRNA相对表达水平,比较统计学差异。1.4 RT-PCR和Western-blotting对胎肝和骨骼ATF4表达分析提取E13.5 WT和HO小鼠胎肝和肋骨笼的RNA和总蛋白,分别用RT-PCR和Western-blotting检测两种小鼠胎肝和骨骼中ATF4在mRNA和蛋白水平的表达差异。1.5组织学及免疫组化增殖分析取E13.5胎鼠的肝脏,常规10%中性福尔马林固定,乙醇逐级脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,切取5μm切片,HE染色,光镜观察。按照相应的操作说明作胎肝（E13.5）和骨组织（E14.5股骨髁）的免疫组化分析,PCNA试剂盒用于增殖分析,ABC法用于ATF4的免疫组化分析,用苏木素复染。1.6统计学处理数据用均数±标准差表示,用SPSS11.5软件包做统计学分析,采用两个独立样本的非参数检验方法进行比较,P＜0.05为统计学有显著性差异。2用组织工程学方法评价PL的生物学效应2.1血小板裂解液对大鼠骨髓间充质干细胞生长和成骨分化的影响2.1.1 BMSCs的分离、培养传代和表型鉴定成年健康清洁级Wistar大鼠8只,体重250-300g,雌雄不限。采用全骨髓分离培养法培养扩增骨髓细胞,隔日半量换液,按1:3比例传代。倒置相差显微镜观察细胞生长。取第5代细胞,进行流式细胞仪检测细胞BMSCs表面特征抗原CD45/CD90/CD29的表达。2.12 PL制备及生长因子含量测定取16只大鼠,采用3次离心结合反复冻融法制备PL,0.22μm无菌滤膜过滤。取6只大鼠PL样品,按照ELISA试剂盒操作说明操作,测取PL中PDGF、TGF-β1、IGF-1和VEGF含量。2.13 PL对细胞生长能力的影响配制含PL终浓度为5%和1%（体积分数）两种不同的条件培养基。取第5代细胞,分A1（基础培养基中含5%PL）、B1（基础培养基中含1%PL）和C1（基础培养基）三组培养,用CASY细胞分析仪测定平均活细胞数,连续培养9天,每组每天测3孔,绘制细胞生长曲线,统计学分析不同浓度PL条件下细胞生长趋势和第9天时各组活细胞数的差异。2.14 PL对BMSCs成骨诱导分化的干预效应2.1.4.1建立成骨诱导体系取第4代细胞,以含有0.1μmol/L地塞米松、50μg/ml抗坏血酸、10mmol/Lβ-磷酸甘油钠及10%胎牛血清的H-DMEM为基础诱导液,配制含PL终浓度为5%和1%（体积分数）两种不同的条件诱导培养基,分别用于A2、B2组细胞的成骨诱导,C2组为不含PL的基础诱导液作为对照。连续培养20天,倒置相差显微镜下连续动态观察细胞形态变化和生长状况。2.1.4.2不同PL诱导分化条件下BMSCs的ALP（碱性磷酸酶）活性和矿化形成诱导7天时,各组细胞作ALP染色,观察胞浆内颗粒情况;诱导2、8和12天时,测取各组3个样本的ALP和TP（总蛋白）含量,以ALP/TP比值作为ALP活性定量指标。诱导20天时,对细胞行Von Kossa染色和Alizarin red染色,观察细胞外基质矿化形成。对Alizarin red染色,每组取3例,每例随取5个视野,用图像分析软件计数单个视野中（×200）矿化结节数量和面积,比较各组差异。2.2 PL/ADBG/CG与BMSCs的生物相容性研究2.2.1同种异体脱钙骨颗粒（ADBG）的制备大鼠10只（同上述）,取四肢骨（包括干骺端）,经深冻、超声清洗、粉碎后筛取直径300-500μm大小的骨粒,于超声条件下0.6N盐酸洗脱、冻干辐照。2.2.2Ⅰ型胶原（CG）与ADBG的双相沉降复合用0.1M乙酸作溶剂将CG配制成质量体积分数为0.25%的胶原溶液,辐照灭菌,4℃条件下将ADBG按质量体积分数为6%的比例加入CG溶液中,搅匀形成混悬液,加1N NaOH将混悬液的PH值调整到7.0左右,这时发生CG和ADBG发生共同沉降粘结,形成凝胶海绵样复合物,CG/ADBG的质量分数约为100mg/1g,取出后用无菌滤纸吸干,-20℃储存备用。2.2.3 PL/ADBG/CG制备、复合培养按5mL PL与5g ADBG/CG比例将两者在4℃无菌条件下浸泡24小时,大约60%PL被吸附于CG/ADBG。取PL/ADBG/CG复合物约100mg置于24孔培养板底部,与第4代BMSCs复合培养7d,倒置显微镜、电镜（3d）观察细胞形态及粘附生长状况。2.3体内移植评价PL的生物学效应2.3.1股骨髁缺损造模及材料移植取大鼠（同上述）30只,分A、B、C三组,每组10只/20侧。无菌条件下制取大鼠双侧股骨髁内60-70%的腔隙性缺损。A、B和C组分别填塞植入等量（大约500mg/缺损）PL/ADBG/CG、ADBG/CG和CG。2.3.2术后缺损修复效果评价指标2.3.2.1 X线及骨密度计量分析术后1-4周时,摄X光片作放射线检查了解新骨生长和缺损修复情况;用Image-Pro Plus 5.0图像分析软件测取2、4周缺损修复区单位面积的灰度值,每组测8个股骨髁,以代替骨密度评价缺损区骨修复状况。2.3.2.2组织学观察及形态计量学分析术后4周,每组随取3只动物,截取双侧股骨髁,经固定、脱钙、脱水、等常规病理操作方法,制作厚度5μm石蜡切片。常规HE染色,光镜观察。每组随取3张切片,每张切片随选5个视野（×200倍）,用Image-Pro Plus 5.0图像分析软件测取缺损修复区单个视野下成骨区面积（以总像素数表示）,比较修复效果。2.3.2.3抗压生物力学测试A、B、C每组随取实验动物3只,截取股骨髁,另取6具同窝大鼠正常股骨髁做对照D组。将股骨髁平置于载物台,压力装置以5mm/min的加载速度施压,电脑记录股骨髁位移达2mm时的破断载荷,并计算破断强度。2.3.2.4三色流式细胞术测定外周血T-淋巴细胞亚群4周处死动物前,A、B和C组各随选3只动物,另取三只同窝正常大鼠作为对照,麻醉后自心内采血2mL,利用三色流式CD4-FITC,CD3-PE和CD8-TC,检测各亚群百分比及CD4/CD8比值。2.4统计学处理用SPSS11.5软件包做统计学分析,数据用均数±标准差表示,采用析因分析交互效应,对于单因素效应采用One-way ANOVA,LSD法用于组间多重比较,P＜0.05为统计学有显著性差异。结果1 Gpr48-cAMP-CREB-ATF4分子信号转导共同调节胚胎红系造血和骨发育1.1 GPR48基因的靶向灭活及其在胚胎期肝脏和骨组织表达在小鼠Gpr48基因序列的内含子1区中随机插入了一个较大的分泌型捕获载体（11.9kb）。这个载体插入引起GPR48基因在小鼠基因组中表达缺失,PCR结果所显示的条带为750bp,而不出现GPR48正常基因条带（450bp）。LacZ组织学染色显示在胚胎E13.5肝脏和骨组织内均有GPR48表达,被染成蓝色,骨骼染色呈强阳性。1.2 GPR48-/-小鼠发育迟滞和红系造血表型大体观察发现与WT相比,E12.5-E14.5 HO胎鼠身体发育低下,体型、肝脏均明显减小,四肢骨骼发育短小,而且胎体和肝脏的颜色较苍白,皮下血管细微不发达。外周血涂片显示HO有核红细胞相对数明显升高,高倍镜下计数结果显示,E13.5天时HO和WT胎鼠的的有核红细胞在总红细胞数中所占的比例分别为（79.91±3.57）%和（30.00±2.17）%,HO比WT提高了约2.7倍水平,两者间比较,z=-3.24,P＜0.01,差异显著有意义;E14.5天时HO和WT分别为（54.99±1.93）%和（27.15±1.88）%,两者间比较,z=-2.45,P＜0.02,差异显著有意义。血红蛋白链Real-Time PCR分析结果:βh1链相对含量（WT为47.17±13.30,HO为113.50±23.44）,β链相对含量（WT为136.50±20.42,HO为62.8±16.13）。与WT相比,HO胚胎血红蛋白βh1链mRNA相对量升高（z=-2.882,P＜0.01,n=6）,差异有显著性意义;而成熟血红蛋白β的mRNA相对表达量则下调（z=-2.882,P＜0.01,n=6）,差异有显著性意义。1.3 ATF4在胎肝和骨中的表达分析胎肝和骨RT-PCR结果显示,HO胎鼠ATF4在约400bp处出现的条带亮度明显弱于WT对照;Western-blotting结果同样显示在约40kD处,HO出现的条带亮度明显弱于WT对照。免疫组化分析显示,ATF在HO胎鼠肝脏和骨组织中的表达呈现弱阳性,显著低于WT中ATF4的表达。1.4组织学及增殖分析肝脏HE染色结果显示,纯合体与野生型相比,肝细胞形态类似,但定向红系祖细胞和红细胞岛明显减少。PCNA增殖分析结果显示HO胎肝（E13.5）和骨组织（E14.5股骨髁）呈现弱阳性染色,处于增殖期的细胞明显少于WT,E14.5HO股骨皮质骨厚度也明显减少。2用组织工程学方法评价PL的生物学效应2.1 PL对大鼠体外BMSCs生长和成骨分化的影响2.1.1 BMSCs的分离、培养、传代和表型鉴定BMSCs经分离培养传至第5代时即纯化为单一纺锤状,规则平行排列,类似于成纤维细胞形态。流式细胞仪分析,这些细胞群落表达的BMSCs特征表面抗原高度均一,呈现CD45^-CD90⁺CD29⁺,符合BMSCs的表型特征。2.1.2 PL中生长因子含量经ELISA定量分析,PL中PDGF、TGF-β1、IGF-1和VEGF浓度分别为405±59.58、140±26.65、85.83±16.86和82.5±11.73（pg/mL）。2.1.3不同浓度PL对BMSCs增殖的影响结果生长曲线显示自第3天开始细胞生长迅速,随着PL浓度的提高和时间延长,各观察点活细胞数呈现递升趋势;A1组细胞增殖较快,在第3天达到对数生长期,比C1组提前约1天。析因分析结果显示,不同浓度的PL对BMSCs的增殖差异有显著性意义（F=320.33,P＜0.01）,培养时间对BMSCs的增殖差异也有显著性意义（F=406.04,P＜0.01）,PL浓度和培养天数之间有交互效应（F=36.25,P＜0.01）,说明随着PL浓度的升高和培养时间的延长细胞增殖呈上升趋势。进一步用TUkey HSD法做差异性检验的多重比较,结果显示A1组对细胞增殖的影响高于B1（P＜0.01）、C1组（P＜0.01）,B1组对细胞增殖的影响高于C1组（P＜0.01）,差异有显著性意义。第9天时各组活细胞数分别为A1（988436±15720.42）个、B1（616666.67±12423.1）个和C1（345000±21931.71）个,单因素方差分析结果显示各组间差异有显著性意义（F=1064.11,P＜0.01）;进一步组间多重LSD比较显示,A1组活细胞数高于B1（P＜0.01）组和C1组（P＜0.01）,B1组高于C1组（P＜0.01）,差异有显著性意义,其中细胞数达到C1组的近3倍水平。2.1.4不同PL条件下对BMSCs成骨诱导分化的影响2.1.4.1不同诱导条件下对BMSCs ALP活性的影响不同PL条件成骨诱导分化下,C2组细胞长突起逐渐变短,胞体变宽、变大,7d时胞浆内出现较多ALP染色阳性的粗大颗粒。B2组与C2组细胞的形态改变相类似,但程度不如A2组明显,而且细胞增殖较C2组快。A2组细胞生长较B2、C2迅速,细胞形态改变不如B2、C2两组显著,胞浆颗粒不发达,细胞处于迅速增殖状态。20天时,B2和C2组细胞外有大量矿物沉积;A2组细胞仍呈密集生长,排列杂乱,细胞外基质中沉积物明显少于B2、C2两组。ALP活性定量分析中,第2、8、12天A2、B2、C2组ALP活性析因分析显示,不同诱导条件下ALP活性的差异有显著性意义（F=45.698,P＜0.01）;进一步组间LSD多重比较显示,P_A2-B2＜0.01,P_A2-C2＜0.01,差异有显著性意义,P_B2-C2＞0.05。不同培养天数间差异有显著性意义（F=121,P＜0.01）,不同的PL浓度与天数对ALP活性的影响存在显著性交互效应（F=6.86,P＜0.01）,以C2组在第12天时的ALP活性最高。2.1.4.2不同诱导条件下对BMSCs基质矿化的影响B2、C2组细胞在20天时在胞外基质中出现大量沉积物,而A2组20天时细胞仍密集生长,胞外基质中沉积物较少。Von Kossa染色和Alizarin red染色显示A2两组矿化沉积明显少于B2、C2组。Alizarin red染色单个视野（×200倍图像）中各组矿化结节计数A2、B2和C2组分别为7.67±1.10、14.0±2.23和14.97±1.88（个）;组间方差分析显示F=14.593,P＜0.01,差异有显著性意义;进一步组间LSD两两比较,A2组矿化结节数显著低于B2（P＜0.01）和C2（P＜0.01）,差异有显著性意义,而B2与C2间无显著性差异（P＞0.05）。A2、B2和C2矿化结节的面积分别为161778.73±44550.80、337349.67±56083.24和415921.73±71725.39（像素）,组间方差分析显示F=14.831,P＜0.01;进一步组间LSD两两比较,A2组钙结节面积显著低于B2（P＜0.01）和C2（P＜0.01）,差异有显著性意义,而B2与C2间无显著性差异（P＞0.05）。2.2 PL/BDG/CG与BMSCs体外共育的生物相容性共育3、7d,倒置相差显微镜显示BMSCs细胞形态无明显异常,材料边缘及周围可见大量BMSCs生长。扫描电镜显示细胞呈长梭形,有多个长突起,紧密贴附于材料表面,融合呈网状连接,有足突状突起向材料内部深入生长。2.3 PL/ADBG/CG体内移植对股骨髁缺损修复重建效果2.3.1放射学及骨密度计量学分析A组,1周时缺损修复区可见少量稀疏絮状阻射影;2周时絮状阻射影密度较前增加;3周时阻射影质地渐趋均匀、致密;4周时缺损中心区阻射影密度接近正常骨质,缺损基本修复。B组,1周时缺损中心区为大量透亮区;2周时阻射影密度较前增加;3周时仍有较多不规则的透亮区;4周时阻射影密度趋于致密,仍有少量不规则的透亮区。C组,1周时缺损仍为明显的透亮区;2周时,A组缺损区有少量模糊阻射影;3周时中心区仍以大量透光区为主;4周时缺损未见修复迹象。灰度（代骨密度）计量分析显示,2周时,组间方差分析F=25.08,P＜0.01,各组灰度值间差异有显著性。进一步组间LSD多重比较,A组单位面积的灰度值高于B组（P＜0.01）和C组（P＜0.01）,B组高于C组（P＜0.05）,差异有显著性意义。4周时方差分析F=29.08,P＜0.01,各组灰度值间差异有显著性。进一步组间多重比较,A组单位面积的灰度值高于B组（P＜0.01）和C组（P＜0.01）,B组高于C组（P＜0.05）,差异有统计学意义。2.3.2组织学及组织计量学分析4周时,A组修复区可见已成活骨片,有较多成骨细胞和新生类骨质长入,也可见正在被吸收的骨片,周围包裹大量纤维组织,伴少量炎细胞浸润;正常骨端向缺损区有大量新生骨延伸和多处软骨内成骨现象,成骨和破骨活动均较B和C组活跃。B组仍有较多死骨存在,可见崩解的碎片和正在被吸收的骨颗粒,有少量骨颗粒成活,但成骨和破骨现象不如A组活跃。C组仍填充以大量纤维组织,周围多处正常骨壁成骨不活跃。经骨组织形态计量学分析,对单个视野（×200倍）中其新生骨软骨和成活的移植骨片总面积（像素值）作方差分析,F=122.398,P＜0.01,差异有显著性意义;进一步作组间两两多重比较,结果显示A组成骨面积高于B组（P＜0.01）和C组（P＜0.01）,B组高于C组（P＜0.01）,差异有有显著性意义。2.3.3抗压生物力学评价各组标本经抗压生物力学测试,对破断载荷和破断强度做方差分析,F=64.469,P＜0.01,差异有显著性意义;进一步作组间两两多重比较,结果显示A组破断载荷和破断能量均高于B（P＜0.01）和C组（P＜0.01）,但低于正常对照D组（P＜0.01）,B组显著高于C组（P＜0.01）,C组最低,差异有显著学意义。2.3.4三色流式细胞术T细胞亚群测定三色流式细胞术分析结果见表2.3.3,经方差分析,CD3⁺CD4⁺CD8^-、CD3⁺CD8⁺CD4^-、CD4/CD8在各组间均无显著性差异（P＞0.05）。结论血液成分（包括红细胞和血小板）与骨组织的发育、再生是存在内在联系的,血小板裂解液可替代多种生长因子应用于骨组织工程方法。1.GPR48-cAMP-CREB-ATF4分子信号转导是红系造血和骨发育共同的转导信号控制通路之一,同时调控小鼠胚胎期红细胞的成熟和骨发育,构成连通血液系统和骨骼组织的分子信号桥梁。GPR48的灭活同时造成红系造血和骨发育缺陷,这对解释临床上某些不明原因的疾病具有潜在的参考价值。2.GPR48信号通路通过调节细胞增殖影响骨和红细胞发育。3.PL由血小板衍生而来,是多种生长因子的承载体系,可参与骨形成调控。PL以剂量依赖方式,对大鼠BMSCs发挥丝裂原作用,促进细胞增殖;而对BMSCs成骨诱导分化过程中的ALP活性和矿化形成呈现剂量依赖性的抑制作用。PL对BMSCs增殖和分化的不一致效应可能对早期骨修复有利。4.PL可作为生长因子用于骨组织工程学方法,所构建的重组合异体脱钙颗粒骨PL/ADBG/CG与BMSCs有良好的生物相容性,复合移植后可促进骨缺损的早期修复过程。5.PL对骨重建有促进作用,可能与多因子协同作用下激发骨吸收-骨形成偶联机制有关。